引物长度一般在5碱基之间

引物设计冷丽2011-04-02引物设计需要考虑的问题引物长度（primerlength）产物长度（productlength）序列Tm值(meltingtemperature)ΔG值(internalstability)引物本身和引物之间二聚体及发夹结构错误引发位点（falseprimingsite）引物及产物GC含量（composition）PCR引物设计原则1.引物长度一般在15~30碱基之间。

引物长度常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。2.引物GC含量在40~60%之间，Tm值最好接近72℃GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，即50%寡核苷酸双链解链的温度。一般有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。PCR引物设计原则3.引物3’端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。4.引物3’端不能选择A。

引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。PCR引物设计原则5.碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。6.引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体的形成。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。PCR引物设计原则7.引物5’端和中间△G值应该相对较高，而3’端较低。△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。8.引物的5’端可以修饰，而3′端不可修饰。引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列。PCR引物设计原则9.扩增产物的单链不能形成二级结构。

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。10.引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。最好与其它基因不具有互补性。PCR引物设计常用软件Primer5，强大的引物搜索功能，限制性内切酶位点分析。Oligo6，引物搜索功能，较强的引物分析评价功能。Primer5的使用方法Primer5的使用方法Primer5的使用方法Primer5的使用方法Primer5的使用方法Primer5的使用方法Primer5的使用方法Oligo6的使用方法Oligo6的使用方法Oligo6的使用方法Oligo6的使用方法Oligo6的使用方法Real-TimePCR引物设计原则做RealTime时,引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：

1）避免重复碱基，尤其是G2)Tm=58-60度。

3）GC=30-80%.

4）3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.

5)PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150bp最为合适（可以延长至300bp）。

6)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；要特