血凝与血凝抑制实验

关于血凝与血凝抑制实验一、实验目的1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操作方法和结果判定方法2、了解新城疫有关背景知识

第2页,共41页，星期六，2024年，5月二、实验内容1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体第3页,共41页，星期六，2024年，5月三、实验原理1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。病毒颗粒红细胞第4页,共41页，星期六，2024年，5月2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。Iamlate！抗体抗原第5页,共41页，星期六，2024年，5月四、实验材料1、血凝板（2人/块）2、新城疫阳性血清3、被检血清（1份）4、1％红细胞悬液5、稀释液6、移液器（50ul,2人/把）7、枪头第6页,共41页，星期六，2024年，5月五、实验方法与结果判定血凝试验（HA)1、在血凝板上第一排的1－12孔内各加入50ul生理盐水2、在第1孔内加入50ul病毒抗原，然后依次倍比稀释至第11孔，最后弃50ul3、每孔加入1％鸡红细胞悬液50ul4、轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分钟5、结果判定第7页,共41页，星期六，2024年，5月1234567891011122×4×8×16×32×64×128×256×512×1024×2048×红细胞对照生理盐水505050505050505050505050抗原5050505050505050505050弃50红细胞505050505050505050505050结果＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－－－血凝效价测定第8页,共41页，星期六，2024年，5月结果判定标准1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集；2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集；3、＋＋：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集；4、＋：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集；5、－：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集；第9页,共41页，星期六，2024年，5月第10页,共41页，星期六，2024年，5月血凝价的判定以出现＋＋（50％凝集）的抗原最高稀释倍数为该抗原的血凝价（1:128）。50ul1:256稀释的病毒抗原为该抗原的一个血凝单位。稀释倍数2×4×8×16×32×64×128×256×512×1024×2048×细胞对照结果＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋————第11页,共41页，星期六，2024年，5月血凝抑制试验1、将病毒抗原稀释成4个血凝单位（1/128×4=1:32）2、在血凝板上1－12孔内各加入50ul生理盐水；3、在第1孔内加入被检血清50ul，然后倍比稀释至第11孔，最后弃50ul；4、第1－12孔内加入4单位抗原50ul（第12孔为病毒对照）；5、每孔加入1％鸡红细胞悬液50ul；6、轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分钟6、结果判定第12页,共41页，星期六，2024年，5月1234567891011122×4×8×16×32×64×128×256×512×1024×2048×病毒对照生理盐水505050505050505050505050血清5050505050505050505050弃504单位抗原505050505050505050505050红细胞505050505050505050505050结果－－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－血凝抑制效价测定第13页,共41页，星期六，2024年，5月结果判定标准1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集；2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集；3、＋＋：红细胞形成一个环状，四周有下凝集块，即50％凝集；4、＋：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集；5、－：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集。第14页,共41页，星期六，2024年，5月血凝抑制价的判定以出现完全抑制凝集(即不凝集)的血清最高稀释倍数为该血清的血凝抑制价（1:4）。稀释倍数2×4×8×16×32×64×128×256×512×1024×2048×血清对照结果——＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—第15页,共41页，星期六，2024年，5月六、注意事项1、红细胞用前请摇匀2、用枪加样定要准，尽量不要有气泡3、结果判定有耐心4、HA和HI勿相混第16页,共41页，星期六，2024年，5月七、新城疫背景介绍第17页,共41页，星期六，2024年，5月鸡新城疫

（NewcastleDiseaseND）

第18页,共41页，星期六，2024年，5月1、概述ND是由ND病毒（NewcastlediseaseVirus,NDV）引起的高度接触性和高度毁灭性的急性败血性传染病。1926年首先发生于印尼，同年发现于英国新城我国1928年有该病记载是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一被国际兽疫局（OIE)列为A类传染病

第19页,共41页，星期六，2024年，5月别名：新城疫、亚洲鸡温、伪鸡瘟鸡瘟：

禽流感、欧洲鸡温、真性鸡温第20页,共41页，星期六，2024年，5月新城疫病毒，属副粘病毒科，副粘病毒属。病毒颗粒表面具有血凝素蛋白，可以刺激机体产生血凝抑制抗体，2、病原体第21页,共41页，星期六，2024年，5月第22页,共41页，星期六，2024年，5月根据临诊表现和病程长短分为：（1）最急性型：突然发病，病变不明显，见于雏鸡及本病流行初期。急性型：（典型新城疫）亚急性型（非典型ND)慢性型（非典型ND）3、病状及病理变化第23页,共41页，星期六，2024年，5月（2）、急性型：侵害消化系统为主，也称嗜内脏速发型。病状特点：a.食欲减退，饮水增加，离群呆立，眼睛半开半闭，翅膀下垂，冠、肉髯呈紫黑色。第24页,共41页，星期六，2024年，5月b.嗉囊积液、体温升高、呼吸困难。鼻腔内有大量分泌物，严重拉稀粪便呈黄绿色或褐色，有时混有血。第25页,共41页，星期六，2024年，5月c.死亡率高,非免疫鸡感染后可以80-100%死亡。d.部分患鸡出现神经症状，头颈歪向一侧而咀向上，母鸡产蛋下降。第26页,共41页，星期六，2024年，5月第27页,共41页，星期六，2024年，5月病变特点：全身的粘膜和浆膜出血，突出病变在消化道。A.腺胃粘膜水肿，粘膜上的乳头及其周围有出血点，间有溃疡。B.腺胃与肌胃、腺胃与食道交界处粘膜可见到出血点或出血带。第28页,共41页，星期六，2024年，5月C.小肠、直肠、泄殖腔粘膜充血、出血或有坏死，D.盲肠扁桃体出血。第29页,共41页，星期六，2024年，5月第30页,共41页，星期六，2024年，5月皮下脂肪出血第31页,共41页，星期六，2024年，5月脑膜充血出血卵黄性腹膜炎第32页,共41页，星期六，2024年，5月有的病鸡表现眼结膜炎第33页,共41页，星期六，2024年，5月

（3）、亚急性型（非典型ND，以侵害呼吸道为主）也称肺脑炎型：其主要的特点：是症状及病变不典型。症状：多见4-35日龄鸡，25日龄前后最常发病。呼吸困难，精神沉郁，继而较早地出现神经症状，此时出现歪头，扭颈，角弓反张，倒地不能起立。第34页,共41页，星期六，2024年，5月病变：喉头及气管粘膜水肿，出血、充血、并有大量粘液，肺呈紫黑色（肺出血性炎症）。硬脑膜下树枝状充血，并有出血点。心冠、脂肪有出血点。发病率高，死亡率较低。第35页,共41页，星期六，2024年，5月（4）、慢性型（非典型ND）母鸡：轻者只表现产蛋率下降（约10-30%），产软壳蛋。重者出现精神沉郁，呼吸困难，黄绿色稀粪，喉头、气管粘膜充血、出血，个别病例出现消化道病变。第36页,共41页，星期六，2024年，5月5、诊断

1、血凝抑制试验（HI）：监测鸡群中的HI抗体，评价疫苗的免疫效果及鸡体内的抗体水平。

2、分离病毒：鉴别弱毒及野毒。（1）分离病毒：强毒：24-72小时鸡胚死亡，弱毒一般不死。第37页,共41页，星期六，2024年，5月6、免疫灭活疫苗（激发体液免疫）活疫苗（激发体液免疫、细胞免疫和局部粘膜免疫）

I系苗、II系苗、III系苗、IV系苗和V4弱毒苗

HI抗体检测：种鸡》1：