NYT 2249-2012 菠萝凋萎病病原分子检测技术规范

菠萝凋萎病病原分子检测技术规范Technicalspecificationofmoleculardetectionforpineapplemeal中华人民共和国农业部发布1NY/T2249—2012下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修政出适用于本文件SN/T1193基因检验实验家技术要求3术语和定义下列术语和定义适用文本文件包括菠萝凋萎伴随病毒(Pineapplemealybugwilir-Lsociated1),菠萝凋萎伴随病毒2号PMWaV=2)和菠萝凋萎伴随病毒3号(PMWaV-3)。工计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而互相结合，接着在DNA聚合RT-PCR是先利用依赖于RNA的DNA聚合酶，将待测RNA逆转录为DNA;再以逆转录后的一tRNAm是携带延长肽链上甲硫氨酸的tRNA,它负责识别延伸中AUG密码子。tRNAm结合区2NY/T2249—2012为基因间隔区，该结合区为所有杆状病毒(Badnavirus)所共有。根据PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的HSP-70特有碱基序列设计特异性引物进行RT-PCR扩增，依据是否分别扩增获得预期的590bp、611bp和499bp的DNA片段，判断样品中是否携带菠萝凋萎伴随病毒；根据PBCoV的tRNA结合区特有碱基序列设计特异性引物进行PCR扩增，依据是否扩增获得预期973bp的DNA片段，判断样品中是否携带菠萝杆状病毒。按B.1和B.2的规定执行。以田间菠萝大苗植株或冠芽较片或波萝组培苗叶片作为检测样品，取样量为1.0g~5.0g,实验室检测用样量为9.1g。7检测方法参照附录B的方法提取检测样品和对照样品的总RNA.段超纯水作为空白对照进行RTPCR扩增。引物正反义扩增片一段长度PMWaV-1RPMWaV-2RPMWaV-3F正义PMWaV-3R7.1.3RT-PCR扩增反应RT-PCR反应体系：苜蓿花叶病毒(AMV)反转录酶反应缓冲液12.5L,分别加入10μmol/L的引物PMWaV-1F、PMWaV-1R.PMWaV-2E,PMWaV-2R与PMWaV-3F、PMWaV-3R各1.5μL,RNA1μL,AMV反转录酶混合液1L,加无RNA酶的超纯水至25μL。RT-PCR反应条件：50℃反转录30min:94℃反应2min灭活反转录酶，94℃30s,不同温度退火(检测PMWaV-1退火温度为60℃,PMWaV-2和PMWaV-3退火温度为55℃)1min,72℃延伸1min,30个循环；最后72℃延伸7min。取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或4℃条件下保存，存放时间不超过24h。7.2.1引物序列PBCoV-F:5'-AGAAAAGAGAATGAACPBCoV-R:5'-AGTGATAAAGGGTCAAPCR片段长度为973bp。37.2.2PCR扩增反应体系：10×PCR缓冲液(Mg²+Plus)2.5μL,TaqDNA聚合酶(5U/pμL)0.25μL,四种脱氧核糖核PCR反应条件：94℃2min;然后进入35个循环，94℃30s,52℃30s,72℃1min;最后72℃延伸10min。取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或4℃条件下保存，存放时间不超过24h。7.3反应体系中对照的设置7.3.1阳性对照样品以温室培养经菠萝粉蚧传毒接种后，呈现典型症状确定感染菠萝凋萎伴随病毒的菠萝叶片为材料，提取总RNA,以其为模板合成cDNA第一链，作为PMWaVs检测体系的阳性对照。以温室培养经菠萝粉蚧传毒接种后，呈现典型症状确定感染菠萝杆状病毒的菠萝叶片为材料，提取基因组DNA,作为PBCoV检测体系的阳性对照。7.3.2阴性对照样品用脱毒的菠萝组培苗提取的总核酸作为样品阴性对照。7.3.3PCR反应体系阴性对照用配制反应体系的无菌超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染。8琼脂糖电泳9凝胶成像分析将电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外凝胶成像仪系统观察窗内，根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，并拍照保存，参考图1和图2。图1菠萝凋萎伴随病毒PCR检测结果电泳图图2菠萝杆状病毒PCR检测结果电泳图4PMWaV-2F、PMWaV-2R与PMWaV-3F、PMWaV-3R)或PCR检测(加入引物PBCoV-F、5A.1.2菠萝杆状病毒状DNA病毒属(Bndnatir显(图A.1)。678