第10章 DNA复制课件

第十章DNA的生物合成

Chapter10

BiosynthesisofDNADNA是由四种脱氧核糖核苷酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核苷酸的排列顺序中。

第10章DNA复制DNAdependentDNApolymerase——DDDPDNAdependentRNApolymerase——DDRPRNAdependentRNApolymerase——RDRPRNAdependentDNApolymerase——RDDP中心法则第10章DNA复制第一节复制的基本规律

一、半保留复制

DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservativereplication)。

半保留复制的意义在于子代保留了亲代的全部的遗传信息，其体现在于代与代之间DNA碱基序列的一致性上。第10章DNA复制basepairingduringDNAsynthesisParentalDNAstrandsDaughterDNAstrands第10章DNA复制

亲代DNA

子代DNA

母链子链

亲代DNA的两条链，都作为复制的模板（母链），严格遵从碱基互补原则合成两条新链（子链），以构成两个子代DNA。子代DNA中有一半直接从亲代保留下来，只有一半是新合成的。半保留复制是遗传的分子基础。第10章DNA复制DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，可得到下列结果：

第10章DNA复制亲代DNA分子第一子代分子第二子代分子15N-DNA14N-DNA混合1

2

3DNA半保留复制及实验依据第10章DNA复制二、有一定的复制起始点DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。E.coli复制起点oriC跨度为245bp第10章DNA复制三、需要引物

参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3’端自由羟基（3’-OH）的RNA作为引物(primer)，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。

第10章DNA复制四、双向复制

DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。

第10章DNA复制

DNA从起始点向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。复制起点复制叉复制子

第10章DNA复制五、半不连续复制由于DNA聚合酶只能催化底物的5-P加合到延长中子链的3-OH上生成磷酸二酯键，决定了延长具有方向性。新链的生成方向只能从53。即以5'→3'方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为3'→5'。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。第10章DNA复制以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为5'→3'，这一条链被称为领头链(leadingstrand)。而以5'→3'方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是5'→3'，这条链被称为随从链(laggingstrand)。第10章DNA复制由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazakifragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。

第10章DNA复制第二节DNA复制的酶学和拓扑学变化

模板单股DNA母链底物dATP，dGTPdCTP，dTTP引物RNA酶及其它辅助因子解旋酶，拓扑酶单链结合蛋白引物酶，引发体聚合酶，连接酶

一.复制所需的物质：第10章DNA复制二.复制的化学反应磷酸二酯键5`3`dNTP+(dNMP)n

PPi+(dNMP)n+1由DNA聚合酶催化第10章DNA复制polynucleotidechain3’,5’-phosphodiesterbondii).StructureoftheDNAdoublehelix第10章DNA复制第10章DNA复制三、DNA聚合酶

(DDDP,DNA-pol)（一）原核生物的DNA-pol在原核生物中，目前发现的DNA聚合酶有三种，分别命名为DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ），DNA聚合酶Ⅱ（polⅡ），DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ），这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与DNA复制的主要是polⅢ和polⅠ。

第10章DNA复制

原核生物中的三种DNA聚合酶

第10章DNA复制(二).真核生物的DNA聚合酶DNA-polα聚合：延长随从链DNA-polβ无其它DNA-pol时起作用DNA-polγ线粒体内，聚合mtDNADNA-polδ聚合：延长领头链DNA-polε校读，修复，填补缺口第10章DNA复制

表：真核生物的DNA聚合酶

DNA聚合酶αβγδε

蛋白质分子量（KD）

>25036-38160-300170256细胞定位核核线粒体核核

5’→3’聚合活性中？高高高3’→5’外切酶无无有有有引物酶有无无无无功能

低保真度的复制起始引发，引物酶活性线粒体DNA复制填补空隙，校读修复延长子链，解螺旋酶活性第10章DNA复制(三).DNA复制的保真性：为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：

1．遵守严格的碱基配对规律；

2．DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择；

3．对复制过程中出现的错误及时进行校正。

第10章DNA复制1.DNA连接酶DNA连接酶(DNAligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，而使两段DNA连接起来。(四).与复制有关的其他酶及蛋白因子第10章DNA复制DNA连接酶催化的条件是：①需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；②未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。第10章DNA复制第10章DNA复制2、单链DNA结合蛋白单链DNA结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）。这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。其作用为：①使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA；②保护单链DNA，避免核酸酶的降解。

第10章DNA复制3、解螺旋酶解螺旋酶（unwindingenzyme），又称解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消耗两分子ATP。目前发现存在至少存在两种解螺旋酶。DnaB蛋白就是解螺旋酶。DnaA蛋白辨认复制起点，DnaC蛋白起辅助作用。

第10章DNA复制解旋酶DnaB辅助因子：DnaA：识别复制起始点DnaC：辅助结合第10章DNA复制4、拓扑异构酶(topoisomerase)拓扑异构酶Ⅰ可使DNA双链中的一条链切断，松开双螺旋后再将DNA链连接起来，从而避免出现链的缠绕。拓扑异构酶Ⅱ可切断DNA双链，使DNA的超螺旋松解后，再将其连接起来。大肠杆菌拓朴异构酶Ⅰ的结构第10章DNA复制5．引物酶（primase）

以DNA为模板，聚合NTP（ATP、GTP、UTP、CTP）成RNA引物。引物酶可催化游离NTP的聚合。如此，可提供3’-OH末端，在DNA-pol催化下逐一加入dNTP而延长DNA子链。在真核生物，引物酶与DNA聚合酶α形成一个复合物，这个复合物合成大约10个核苷酸长的RNA引物第10章DNA复制第三节DNA生物合成过程1.复制的起始DNA解成双链引发体的生成2.复制的延长领头链随从链3.复制的终止原核生物真核生物：端粒和端粒酶第10章DNA复制一.复制的起始原核生物只有一个复制起始点

E.colioriC245bp识别区，AT富含区真核生物：

有多个复制起始点(originsofreplication,ori)。复制起始点有特殊的序列，也含有AT富含区。第10章DNA复制1.DNA解成单链DnaA识别起始点DnaBDnaC结合上来解链SSB结合复制叉形成复制叉：复制时双链打开，分开成两股，新链沿着张开的模板生成，复制中形成这种Y字形的结构。复制子：真核生物有多个复制起始点，同时形成许多复制的单位，两个起始点之间的DNA片段，称为一个复制子。第10章DNA复制2.形成引发体并合成引物与起始点相结合的DnaB、DnaC蛋白，以及引物酶DnaG和DNA起始复制区域，共同构成引发体。其中的引物酶催化一段短RNA引物（10-60核苷酸）合成，为复制的延长阶段提供3’-OH末端。原核：DnaB、DnaC、DnaGTopoⅠ，TopoⅡ真核：DNA聚合酶α，DNA聚合酶δ

PCNARFTopoⅠ，TopoⅡ

引发体的蛋白质部分可沿DNA链移动，以合成RNA引物。领头链一次引发可连续进行DNA复制；随从链则须多次引发进行不连续的复制。第10章DNA复制引物酶本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由的3'-OH，使子代DNA链能够开始聚合。

第10章DNA复制originsofDNAreplication(every~150kb)replicationbubbledaughterchromosomesfusionofbubblesbidirectionalreplicationOriginsofDNAreplicationonmammalianchromosomes5’3’3’5’5’3’3’5’3’5’5’3’第10章DNA复制InitiationofDNAsynthesisattheE.coliorigin(ori)5’3’3’5’originDNAsequencebindingofdnaAproteinsAAAdnaAproteinscoalesceDNAmeltinginducedbythednaAproteinsAAAAAAAAAAAABCdnaBanddnaCproteinsbindtothesingle-strandedDNAdnaBfurtherunwindsthehelix第10章DNA复制AAAAAABCdnaBfurtherunwindsthehelixanddisplacesdnaAproteinsGdnaG(primase)binds...AAAAAABCG...andsynthesizesanRNAprimerRNAprimer第10章DNA复制BCG5’3’templatestrandRNAprimer(~5nucleotides)PrimasomednaB(helicase)dnaCdnaG(primase)OH3’5’第10章DNA复制二、复制的延长

在RNA引物3’-OH基础上，进行DNA链5’-3’方向的合成。领导链连续的合成出一条长链；随从链则合成许多冈崎片段。

DNA链的延长是在DNApol催化，4种dNTP为原料，按照与模板DNA碱基互补的原则（A=T，C≡G），从5’→3’方向逐个加入dNTP，使DNA链得以延长。原核：DNApolⅢ真核：DNApolδ第10章DNA复制3’5’3’RNAprimernewlysynthesizedDNA5’5’DNApolymerase第10章DNA复制领头链：顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，称为~随从链：另一股链的复制方向与解链方向相反，它的复制必须等待模板链解开至足够长度，才能继续复制，因此它的复制是不连续复制，称为~冈崎片段：不连续复制的片断，大小不等，每个片段的5`端都带有一个引物第10章DNA复制RNAprimer5’3’3’5’3’5’directionofleadingstrandsynthesisdirectionoflaggingstrandsynthesisreplicationfork第10章DNA复制5’3’5’3’Movementofthereplicationfork第10章DNA复制MovementofthereplicationforkRNAprimerOkazakifragmentRNAprimer5’第10章DNA复制DiscontinuoussynthesisofDNA3’5’5’3’3’5’BecauseDNAisalwayssynthesizedina5’to3’direction,synthesisofoneofthestrands...5’ 3’ ...hastobediscontinuous.Thisisthelaggingstrand.5’3’3’5’5’3’第10章DNA复制第10章DNA复制

填补空隙，连接片段，半保留方式生成子代DNA。

RNA酶，DNApolⅠ，DNApolε，DNA连接酶原核：环状双链真核：线性结构三、复制的终止

第10章DNA复制原核生物RNA酶水解掉引物DNA-polⅠ填补空隙DNA连接酶连接缺口（耗能）真核生物水解引物-填补-连接最前端的引物水解掉后存在一个空隙端粒端粒酶第10章DNA复制真核生物端粒的形成：端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、C的短重复序列构成，可重复数十次至数百次。

第10章DNA复制TelomerestelomereMetaphasechromosomecentromeretelomeretelomerestructureyoungsenescent(TTAGGG)many(TTAGGG)few<1to>12kb第10章DNA复制端粒酶（telomerase）是催化端粒合成的酶。端粒酶是由蛋白质及RNA组成的，它具有逆转录酶的活性，能与自身携带的RNA为模板，逆转录合成端粒DNA

第10章DNA复制

端粒DNA：人的DNA的3’末端存在的重复顺序（TTAGGG）n

端粒酶：催化端粒DNA的复制，酶本身含有与端粒DNA序列互补的RNA片段。第10章DNA复制端粒酶(telomerase)的作用机制第10章DNA复制第10章DNA复制第四节逆转录现象和逆转录酶逆转录是RNA病毒复制的形式。逆转录反应包括以RNA为模板合成DNA，杂化双链RNA水解和以单链DNA为模板合成双链DNA三步反应。该三步反应的催化是由逆转录酶来完成的。在基因工程操作中，可用逆转录酶来制备cDNA。第10章DNA复制RNA模板RNADNADNA双链DNA逆转录酶逆转录酶逆转录酶病毒细胞内第10章DNA复制RNADNADNA双链DNA（cDNA）逆转录酶Klenow片段碱水解mRNA模板实验室第10章DNA复制第五节DNA的损伤与修复

一、DNA的损伤（突变）

由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤，也称为突变（mutation）。突变是进化的分子基础.常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重组等。

第10章DNA复制（一）引起突变的因素：1．自发因素：

(1)自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。

(2)自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。

(3)复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。

第10章DNA复制2．物理因素：由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。

第10章DNA复制3．化学因素：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成I。

第10章DNA复制（二）DNA突变的类型：

第10章DNA复制（三）DNA突变的效应：

1．同义突变：基因突变导致mRNA密码子第三位碱基的改变但不引起密码子意义的改变，其翻译产物中的氨基酸残基顺序不变，但有时可引起翻译效率降低。

2．误义突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换，其意义发生改变，翻译产物中的氨基酸残基顺序发生改变。

3．无义突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换而改变成终止密码子，引起多肽链合成的终止。

4．移码突变：基因突变导致