酵母核糖核酸的分离及组分鉴定专家讲座

试验目标1、学习稀碱法提取酵母RNA粗制品原理和方法。2、了解核酸组分，并掌握判定核酸组分方法。3、学习离心机使用方法。酵母核糖核酸的分离及组分鉴定专家讲座第1页离心机原理和应用离心就是利用离心机转子高速旋转产生强大离心力，加紧液体中颗粒沉降速度，把样品中不一样沉降系数和浮力密度物质分离开。rpm—revolutionsperminute每分钟转数RCF---Relativecentrifugalforce相对离心力，是指在离心场中，作用于颗粒离心力相当于地球重力加速度g倍数

4000rpm4000g

RCF=1.119×10－5×(rpm)2r

其中r表示离心机转轴中心与离心管中心距离单位为cm。因为离心管位置由转子（rotor）决定，所以r必须由查阅相关转子参数而得。

使用注意：配平！离心参数调整：转头，转速和离心时间酵母核糖核酸的分离及组分鉴定专家讲座第2页酵母核糖核酸的分离及组分鉴定专家讲座第3页核糖核酸（Ribonucleicacid，RNA）

由核糖核苷酸经过磷酸二酯键连接而成一类核酸,因含核糖而得名。RNA种类：mRNA，tRNA和rRNA，另外snRNA（年诺贝尔医学奖）。核苷-5´-磷酸酵母核糖核酸的分离及组分鉴定专家讲座第4页酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体2.67%-10.0%，而DNA含量仅为0.03%-0.516%。工业上制备RNA多项选择取成本低、适于大规模操作稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取核酸均为变性RNA，主要用作制备单核苷酸原料，其工艺比较简单。应用领域：调味品和食品添加剂酵母核糖核酸的分离及组分鉴定专家讲座第5页试验原理稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，离心除去蛋白质和菌体后，上清液用乙醇使RNA沉淀，由此即得到RNA粗制品。RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分，加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中能够判定上述组分。酵母核糖核酸的分离及组分鉴定专家讲座第6页RNA组份判定（1）嘌呤碱与硝酸银作用产生白色嘌呤银化合物沉淀。（2）苔衣酚显色法：核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成核糖继而转变为糠醛，后者与苔衣酚（3，5-二羟基甲苯）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂。（3）磷酸与定磷试剂中钼酸铵作用生成磷钼酸，并被Vc还原成蓝色复合物钼蓝。酵母核糖核酸的分离及组分鉴定专家讲座第7页试验仪器1.研钵2.水浴锅3.量筒4.滴管5.试管及试管架6.烧杯7.离心机8.锥形瓶酵母核糖核酸的分离及组分鉴定专家讲座第8页试剂和材料1.0.04mol/L氢氧化钠溶液6.定磷试剂2.三氯化铁浓盐酸溶液7.酸性乙醇溶液3.0.1mol/L硝酸银溶液8.苔黑酚乙醇溶液4.1.5mol/L硫酸溶液9.酵母粉5.浓氨水酵母核糖核酸的分离及组分鉴定专家讲座第9页操作步骤（一）酵母RNA粗制品提取1、将酵母片在研钵中研磨均匀，称取4g酵母粉悬于30mL0.04mol/LNaOH溶液中(锥形瓶)。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。2、4000r/min离心5分钟后，分成上清和沉淀两层，沉淀主要成份就是变性蛋白质，RNA包含在上清中。酵母核糖核酸的分离及组分鉴定专家讲座第10页3、将上清液缓缓倾入30mL酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，离心（4000rpm）5分钟。弃去上清液。注：离心前，离心管（包含转头）一定要对称两管在天平上配平，第一次用NaOH溶液，第二次用酸性乙醇。两次使用胶头滴管要分开放置酵母核糖核酸的分离及组分鉴定专家讲座第11页（二）组分判定1、水解：提取核酸溶解于10mL1.5mol/L硫酸溶液中，在沸水浴中加热10min制成水解液，进行组分判定。酵母核糖核酸的分离及组分鉴定专家讲座第12页2.嘌呤碱：取一只试管，加入1ml水解液，加入过量浓氨水（用胶头吸管吸2管约2ml），再加入1ml0.1mol/L硝酸银，观察有没有白色嘌呤碱银化合物沉淀生成。嘌呤银络合物在碱性条件下易形成白色絮状沉淀。酵母核糖核酸的分离及组分鉴定专家讲座第13页3.核糖：取一只试管，加入水解液1ml，三氯化铁浓盐酸溶液2ml，加入苔黑酚乙醇溶液0.2ml，放入沸水浴中5min。注意溶液是否变墨绿色。核糖在浓盐酸中，与苔黑酚（3，5-二羟甲苯）及三氯化铁盐酸试剂共热，产生绿色络合物。酵母核糖核酸的分离及组分鉴定专家讲座第14页4.磷酸：取一只试管，加入水解液1ml和定磷试剂1ml，在沸水浴中加热。观察溶液是否变成蓝色。磷酸与钼酸铵试剂作用产生磷钼酸，磷钼酸在还原剂抗坏血酸(Vc)作用下形成蓝色复合物钼蓝。酵母核糖核酸的分离及组分鉴定专家讲座第15页1.稀碱法提取RNA为变性RNA，可用于RNA组分判定及单核苷酸制备，不能作为RNA生物活性试验材料。2.苔黑酚反应特异性较差，凡戊糖都有此反应。所以地衣酚试验不能作为RNA与DNA判别依据。。3.试剂瓶中溶液用胶头滴管取用，吸1管约为1毫升，0.2ml用胶头滴管取4滴即可（每滴约为0.05毫升），4.离心：两组配平5.请将试剂瓶放在原处取用，以免其它同学不能找