遗传工程动物

遗传工程动物

一.转基因动物概念所谓转基因动物就是把外源性目的基因导入动物的受精卵或其囊胚细胞中，后改用注入受精卵的任何一个前核，并在细胞基因组中稳定整合，再将合格的重组受精卵或囊胚细胞筛选出来，采用借腹怀孕法寄养在雌性动物（fostermother）的子宫内,使之发育成具表达目的基因的胚胎动物,并能传给下一代。这样，生育的动物为转基因动物。这类动物由于外源性目的基因的稳定存在而赋于子代动物个体。转基因动物研究大事记1.追溯20世纪60年代末和70年代初就有人向蛙卵和小鼠胚胎注射mRNA，研究mRNA能不能在动物卵细胞和早期胚胎中翻译。

2.1974年，Jaenisch和Mintz首次报道应用显微注射法获得SV40DNA转基因小鼠。

3.1982年Palmiter成功获得了含金属巯基(MTI)基因启动子与大鼠生长基因的融合基因的转基因小鼠。体重远大于正常对照，被称为“超级小鼠”(Supermice)。4.1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌α—抗胰蛋白酶。1989年，意大利学者用精子作为载体，成功地获得了纯系转基因小鼠。1997年2月，英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多利”培育成功。1997年10月，英国罗斯林研究所宣布已克隆出3只携带有人凝血因子Ⅸ基因转染绵羊。

1999年2月，上海遗传研究所宣布转基因试管牛“滔滔”诞生，其体内被检测到带有人的血清白蛋白基因，这项成果被评为当年“中国十大科技进展”之一。2000年6月22日晚8时整，生物胚胎工程专家张涌教授在西北农林科技大学种羊场顺利接生了一只雌性体细胞克隆山羊阳阳。2001年英国PPL公司宣布获得世界首例转基因克隆猪诞生。转基因超级鼠1982年，英国的《自然》杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中,培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快2～3倍，体积大一倍。Supermice上海医学遗传研究所宣布：取名为“滔滔”的我国首例转基因试管牛于1999年2月19日在上海市奉贤县奉新动物试验场诞生，出生时体重38公斤，经检测它携带有人血清白蛋白基因。这是继去年成功地培育出在乳汁中含有人凝血因子IX的转基因山羊后，该所获得的又一项重大科研成果。2000年6月，张涌教授培育成功世界首批体细胞克隆山羊“元元”、“阳阳”。图为利用体细胞克隆的山羊“阳阳”（左）和它的克隆体山羊。2006.12.３头口、蹄及舌头呈现出绿色荧光的转基因克隆小猪日前在东北农业大学顺利降生。这是中国培育出的首例绿色荧光的转基因猪，也是世界上第四例通过体细胞核移植技术培育的该类转基因猪。

二、转基因动物基本程序(一）待转移的目的基因的获得与设计(二)动物遗传背景及种系的选择在进行转基因动物研究时要考虑遗传背景及种的问题。(三)常用的细胞

1）受精卵：受精卵→基因操作→注射假孕动物子宫→胚胎→个体。

2）胚胎干细胞：从着床前的动物胚胎中分离多功能胚胎干细胞→基因操作→注射入动物囊胚→形成嵌合体胚胎→嵌合个体。(四)外源基因的导入的方法(五)转基因动物中外源基因的检测和传代(一）待转移的目的基因的获得与设计

1、目的基因的来源①采用限制性内切酶，从生物组织中获取目的基因；②通过mRNA合成cDNA；③人工合成的DNA片段；④聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段。2、目的基因的克隆通过载体在适当的宿主中克隆选择载体目的基因与载体的连接重组体导入受体细胞通过PCR反应克隆目的基因3、基因构建现代转基因技术中的“基因”不是仅仅是目的蛋白编码序列(codingsequence)的DNA片断，而是包括基因表达的一整套顺式作用元件(cis-actingelements)。①、启动子（promotor）

启动子位于基因转录起始位点上游不远处，往往含有TATA框以及一些短的调控序列，也有一些启动子不含TATA框而还有Inr序列。启动子序列是构建转基因表达载体时首先要具备的生物元件。组织特异性启动子(tissue-specific)在动物体中，除了那些担负基本生命功能的持家基因(House-keepinggene)以外，绝大多数基因呈组织特异性表达。要使转入的外源基因在特定的组织中表达，就要使用组织特异性启动子。对大多数基因来讲，我们还只能分离它近5’端的启动子。及近5’端和近3‘端的增强子，有时还要将一个或几个内含子包括在内，即便如此，往往还是不能达到完全的组织特异性.得到组织特异性表达启动子启动子表达的组织CMV各种组织WAP乳腺β-Lactoglobulin乳腺Albuminenhancer肝脏αmyosinheavychain心脏②、增强子（enhancer）真核基因的表达除了受位于转录起始位点附近的DNA序列的调控外，还要受到距离很远的一类调控序列的调控。这类序列叫做增强子，其本身不具有启动子的功能，但能够使启动子的转录活性提高数百倍。③、目的基因

目的基因的序列应该包含至少一个开放阅读框（ORF），即含有起始密码子和终止密码子的一段基因序列。以往构件目的基因时一般使用基因文库中的cDNA序列，但实践证明仅仅有cDNA序列往往难以得到有效表达，至少一个内含子与cDNA序列结合会使基因得到更好的表达。④、报告基因（reportergene）或标记基因

常用的报告基因有β-半乳糖苷酶(lacZ)、大肠杆菌氯霉素乙酰基转移酶CAT(chloramphenicolacetyltransferasegene)、萤火虫的荧光素酶基因（fireflyluciferasegene）、绿色荧光蛋白基因（GFP）和人生长激素基因（hGH）等。这些报告基因都能产生各自特有的化学或发光反应，使对结果的观察变得简单明了。⑤、多聚腺苷酸化信号真核生物的mRNA在完成转录后，其3、端要经历进一步修饰，其间相当一段原始转录物被切掉，并在结尾之处装上可多达200个的腺苷酸残基。(二)动物遗传背景及种系的选择在进行转基因动物研究时要考虑遗传背景及种系的问题（三）外源基因导入受精卵或胚胎细胞的常用方法显微注射法逆转录病毒感染法胚胎干细胞法精子载体导入法细胞核移植法生殖细胞转染法（一）、显微注射法1.目的基因的制备与纯化2.卵供体母鼠和假孕母鼠的准备3.超排卵与取卵4.基因显微注射5.受精卵移植6.目的基因的表达整合鉴定和检测

7.建系优点：转基因范围广，转移基因大，可达数百kb；且转基因不含任何病毒基因组片段，绝对安全。缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不表达；整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位缺失等；需显微操作仪，技术性要求强。显微注射法

(二)逆转录病毒介导法慢病毒性载体体积较小，不适合携带太大的(>10kb)的DNA片段。使用病毒性载体时，要注意安全。为了确保病毒性载体的安全性，以下技术已经用于构建病毒性载体：

首先，消除其复制能力，使其不能自我增殖。因此只能反转录一次。

其次，改变其包装性状，使其只能在特定细胞系中包装而获得感染能力。此外，引入基因突变，使其转录功能失活。虽然通过酶切修饰和重组等技术可以去除或者减少病毒性载体的治病性，但是，不同来源的病毒性载体，其结构和安全性可能有所不同，要选择适当的慢病毒性载体，必要时要进行进一步修饰重组并反复验证，确保安全。在包装时，每次只能包装一种载体，以免发生DNA重组，从而产生致病性。

第三，在专用工作台上操作，并且要采取适当的防护措施。逆转录病毒结构LTR:Longterminaterepeat1、逆转录病毒法制备转基因动物目的基因插入区域逆转录病毒法基本步骤构建病毒载体转染包装细胞收集病毒颗粒感染受精卵胚胎移植表达gag,pol,env

细胞逆转录病毒法制备转基因动物的优缺点

优点转基因效率高单位点、单拷贝整合，易分析插入位点鸡卵等含卵黄多的受精卵适宜

缺点随机整合携带外源DNA片段大小受限，一般小于10kb易产生嵌合体（mosaic)，实验周期长有安全隐患，有可能因DNA重组产生活病毒。（三）.胚胎干细胞法将ES细胞植入动物囊胚后,可参与宿主胚胎的形成,直至达到种系嵌合,因此,可将其作为一种载体,把外源DNA导入ES细胞就可以实现由此发育而成的转基因动物。该方法的优点是外源基因的整合率很高,约50%,整合率在生殖细胞中的比例约为30%。缺点是不易建立ES细胞系。利用胚胎干细胞法制备转基因小鼠的过程1.分离培养ES细胞。

2.ES细胞基因操作。

3.获取囊胚期胚胎，以作为ES细胞的移植受体。4.通过显微操作将ES细胞注射到囊胚期胚胎的囊胚腔内，形成嵌合体。

5.将注射过ES细胞的胚胎，移植到交配后3d的假孕母鼠子宫内，培育出转基因小鼠。优点：基因转移效率大大提高，且能进行定位基因转移。缺点：需要多代才能得到纯合的转基因动物，这对饲养成本高，产仔数较少的大型哺乳类动物来说，要获得转基因动物是一件需要大量资金投入的事情。(四）精子载体法

意大利Lavitrano等1989年首次报道利用精子作为载体获得了转基因小鼠。

精子载体法是精子和外源DNA混合培养时，外源DNA可直接进入精子的头部，通过受精将外源基因引入动物细胞中。外源DNA导入精细胞的方法有DNA与精子共育法、电穿孔导入法、脂质体转染法。（五）细胞核移植法先在体外培养的体细胞中进行基因导入并筛选。然后将带转基因体细胞移植到去掉细胞核的卵细胞中，生产重构胚胎.（六）生殖细胞转染法四、外源DNA整合、转录及表达的分子检测1）外源基因的整合检测PCRDot-blotSouthern-blot2）外源基因的转录检测northern-blot原位杂交3）外源基因的表达检测血液生化ELASA

病理、免疫组织化学基因产物的检测western-blot4.基因动物品系或品种的建立

第一代转基因动物是半合子转基因动物，因为外源基因仅在一条染色体上稳定整合。只有通过选种选配，将两个半合子转基因动物成功交配，才能得到纯合子转基因动物，建立转基因动物家系，外源DNA才能在后代中稳定遗传

纯系转基因动物的培育

Founder小鼠╳正常小鼠

F1阳性小鼠（AO）

F1阳性小鼠（AV）╳正常小鼠近亲繁殖以得到纯合小鼠

F2阳性小鼠（AO）

F2（AO）╳F2（AO）

F3（1/4AA，1/2AO，1/4OO）

F3（AA）╳F3（AA）纯合子小鼠交配得到稳定品系

F4（AA）G0代编号检测（3周龄）PCRSouthernG0代整合检测--：弃去+：保留X野生型G1代--：弃去+：半合子X半合子--：弃去+：纯合子G2代表型检测founder鼠互交五.转入基因的整合和表达外源基因进入细胞后的命运整合到染色体内

随机整合定点整合游离在细胞浆内暂态表达在核酸酶的作用下降解随机整合（Randominsertion）

外源基因随机插入到染色体的任意部位。插入到致死基因序列内：胚胎死亡插入到功能基因序列内：基因失活插入到某调控区作用范围：外源基因表达增强/减弱转基因的整合和表达特征①1-100拷贝左右的外源基因以头尾相连成串的方式整合到小鼠染色体上;②外源基因的整合绝大部分是随机整合;

③转入基因整合是稳定的，一部分按孟德尔方式遗传给后代，还有一部分为嵌合体

④转基因表达的强弱与整合的拷贝数无关，而与“位置效应”有关;⑤转基因的特异性表达可以只在一种类型细胞中或少数几种不同类型细胞中，也可以在许多类型细胞中表达;⑥转基因构件中原核生物的序列可能会抑制某些基因表达;⑦没有内含子的cDNA基因的表达比基因组DNA基因表达要弱得多;⑧少数转基因位点的两侧序列有重排现象。提高转基因表达的策略1.导入大片段（LCR序列）2.共整合和基因搭救这可能是一种很有用的策略，即将表达水平较高的基因与另外一些表达水平低的基因一同整合进宿主细胞的基因组中(同一位点串联整合)，这样的处理对增强表达水平低的基因构件的表达具有明显的作用。3.增添基质附着区核基质附着区(MAR)可能是结构基因的界域，它将染色质分成许多可独立调控的单元。构件太大MAR＋LCR＋转基因构件不受位置效应的表达六、转基因动物的应用1、研究基因的结构和功能及其表达与调控

2、建立人类疾病动物模型3、研究人类疾病基因治疗

4、研制生物反应器，生产天然活性药物蛋白

6、改良和培育动物新品种

肿瘤转基因小鼠的模型

SV40T小鼠肿瘤模型的建立猿猴病毒SV40作为一种致瘤DNA肿瘤病毒被广泛证实可引起物多种肿瘤形成，其致瘤作用主要通过其早期区域基因编码产物大T抗原实现。SV40T影响细胞周期调控蛋白P53的功能；SV40T与肿瘤抑制蛋白RB，使其丧失功能。此外还与多种转录因子和细胞周期调控蛋白作用，致使细胞分裂加速，形成肿瘤，是致癌机理研究的较为透彻的一种蛋白。

脑癌胰腺癌转基因生物反应器

□定义：将目的基因导入动物体内形成转基因生物，由于基因表达，可以从转基因动物的特定组织或器官（乳汁、血液等）获得目的基因产物。使转基因动物象一个活的发酵罐一样来生产目的基因的产物。

□步骤（图）：采用上述方法获得的转基因羊，可从羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA（组织溶解酶原激活剂）。十大神奇转基因动物

这些五彩斑斓的脑细胞是单个的神经元，鲜艳的色彩帮助科学家将它们区分开来。哈佛大学的杰夫-里奇曼为首的科研小组在实验鼠的基因组中导入水母的绿色荧光蛋白基因，使其在紫色光线的照射下呈现出绿色荧光。这种绿色荧光基因对小鼠无害，只起到标记作用。荧光鼠七.转基因动物存在的问题发展趋势

1.转基因动物的成功率和成活率极低2.难以控制转基因在宿主基因组中的行为3.大部分转基因表达水平极低，而极少部分转基因表达水平过高4.阳性转基因动物筛选不易八.转基因动物的安全性问题外源基因的插入可能对宿主动物自身有影响,造成基因污染对生态平衡以及物种的多样性造成不良影响;转基因移植可能加大“人畜共患病”的传播机会,给人类带来灾难性的损坏;

转基因动物制品的安全性也是值得谨慎的一个环节,因为它有可能导致过敏等反应;转基因动物的研究将导致一场社会伦理的大讨论。小结转基因技术是在基因重组基础上建立新的多细胞真核生物的方法。这是一个具有重大意义的革命性的突破。它为我们培育新的物种提供了新的思路，为我们研究基因的功能，研究疾病发生的机理提供了有力的手段

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二.基因敲除动物

(geneknockoutanimals)什么是基因敲除技术？1987-89年

MartinEvans，OliverSmithies和MarioCapecch领导的几个研究小组首次对胚胎干细胞中特定目标基因进行失活，培育出了第一只基因敲除小鼠。到目前为止，已经培育出上千种基因敲除小鼠。三种技术的融合

二、基因敲除的基本程序1、构建打靶载体

1）同源序列

2）打靶载体常含两种筛选标志

neor：新霉素抗性基因，阳性筛选标志，neor基因插入用于打靶的外源DNA中，当重组后，细胞能在含新霉素的培养基中生长。neorHSV-tkHSV-tk(更昔洛韦)：单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因，阴性筛选标志，该基因产物可分解单核苷酸类似物而生成毒性产物，产生自杀效果。

HSV-tk基因插入外源基因外侧的载体序列中。同源重组时，Tk-基因往往丢失；随机整合时，Tk-基因连同打靶载体整合到核基因组上，而同时获得neo和HSV-tk两个基因的打靶细胞。启动子HSV-TK同源序列同源序列Neo随机整合同源重组2、将载体导入ES细胞选取发育第4-5天的胚胎干细胞(ES)

。把外来基因转入胚胎干细胞。并筛选打靶成功的细胞。3、将基因敲除ES细胞注射入胚泡，形成嵌合胚胎。4、将10-20个胚泡植入假孕小鼠子宫。5