动脉粥样硬化免疫机制的研究进展专家讲座

动脉粥样硬化免疫机制

研究进展

南华大学心血管病研究所杨永宗.8.15.-8-151动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第1页一、前言AS病变炎症性质以及一系列炎性因子在AS病变形成中关键作用几已成为共识。但数以百计危险原因怎样开启炎症过程而促成AS病变发生发展却还是个未解问题。

天然免疫模式识别理论提出将开辟AS病变发生发展机理研究新领域。-8-152动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第2页二、天然免疫模式识别理论关键点美国免疫学家Janeway提出天然免疫模式识别理论，强调天然免疫对取得性免疫指导和调控作用，指出抗原递呈细胞（APC）是紧密地连接天然免疫与取得性免疫桥梁。天然免疫系统经过APC上模式识别受体(PRR)识别病原相关分子模式(PAMP)，区分“自己”与“非己”及无害“非己”和病原体相关“非己”,并籍抗原递呈和共刺激信号两个步骤赋予取得性免疫识别“自己”“非己”能力。-8-153动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第3页病原相关分子模式

（pathogen-associatedmolecularpattern）

PAMP是指一大组或某几大组病原体所共有一个分子模式(moleculepattern)，而非某一特定结构。PAMP是病原体保守结组成份且对其生存是必要,如发生突变,将使病原体死亡或丧失致病性。PAMP不一样于宿主机体本身成份。

-8-154动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第4页Janeway提出模式识别理论，将天然免疫针正确主要靶分子信号称为病原相关分子模式（Pathogen-associatedmolecularpattern,PAMP），将其对应识别受体称为模式识别受体（patternrecognitionreceptor,PRR）。PAMP主要指广泛存在于病原体细胞表面分子标志，如酵母细胞壁上甘露糖、以及各种细菌细胞壁成份如脂多糖、多肽糖、胞壁酸等，这些分子在进化过程中都趋于保守。-8-155动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第5页模式识别受体

(patternrecognitionreceptor)

与PAMP对应识别受体称为模式识别受体（PRR）。已克隆PRRｓ大多属于Toll样受体(TLRs)家族,清道夫受体尤其是SR-A1也含有PRR功效。TLRs广泛表示在各种淋巴细胞表面，包含非特异性免疫细胞巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞，和特异性免疫Ｔ淋巴细胞和Ｂ淋巴细胞。其中单核细胞分化树突状细胞是唯一表示全部5种TLR细胞,也是唯一表示TLR3细胞。

-8-156动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第6页1.病原微生物感染

相关病原体研究包含肺炎衣原体、幽门螺旋杆菌、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、肝炎病毒等。其中肺炎衣原体在AS斑块发生中作用已经有较多研究，但现在认为单一病原体感染在AS中作用可能很小，而多重感染并存则是影响心血管疾病主要原因。-8-157动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第7页内毒素作用ControlGroupEndotoxinGroup-8-158动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第8页Group vWF(%) tPAactivity PAIactivity

(Iu/mgprotein) (Au/mgprotein)Endotoxin 0.556±0.048* 0.227±0.048* 5.36±0.28*Control 0.100±0.050 0.643±0.080 1.25±0.40*P<0.05comparedwithcontrol.内毒素对内皮细胞功效影响-8-159动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第9页ControlCoronaryArteryfromPatient

肺炎衣原体-8-1510动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第10页A1:ControlA2:106IFUs/LAR-39B1:10mg/LLDLB2:10mg/LLDL+106IFUs/LAR-39C1:10mg/LoxLDLC2:10mg/LoxLDL+106IFUs/LAR-39肺炎衣原体对细胞胆固醇蓄积影响-8-1511动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第11页A1:对照组A2:cpnB1:LDLB2:LDL+cpnC1:ox-LDLC2:ox-LDL+cpn肺炎衣原体对C57BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞泡沫化影响-8-1512动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第12页多重感染并存流行病学资料显示，冠心病患病危险度与感染病原体种类多少相关，而且存在各种感染是冠心病患者发生心肌梗死独立危险原因。现在认为单一病原体感染在AS中作用可能很小，而多重感染并存则是影响心血管疾病主要原因。Circulation.;103:45-51.

ProspectiveStudyofPathogenBurdenandRiskofMyocardialInfarctionorDeath-8-1513动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第13页

2.氧化修饰低密度脂蛋白A对照组B试验组小鼠腹腔巨噬细胞猪主动脉平滑肌细胞-8-1514动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第14页人U937细胞透射电镜照片人外周血单核巨噬细胞人THP-1细胞-8-1515动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第15页Proc.Natl.Acad.Sci.USAVol.92,pp.3893-3897,April1995Tlymphocytesfromhumanatheroscleroticplaquesrecognizeoxidizedlowdensitylipoprotein-8-1516动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第16页AS患者血清和斑块可检测到oxLDL抗体。斑块中分离出CD4+T细胞可识别oxLDL。oxLDL抗体可分为IgG和IgM型。IgG抗体水平增高与AS病变程度加重相关，而IgM型oxLDL抗体与AS病变呈负相关。-8-1517动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第17页用oxLDL免疫兔可降低40%～50%AS病变，在apoE和LDLR敲除小鼠研究中也取得类似结果。Shaw等人用肺炎链球菌感染LDLR缺乏小鼠，诱导小鼠体内高水平IgM型oxLDL抗体产生。伴随脾脏内B淋巴细胞连续分泌IgM增高，AS病变程度降低。用apoB-100肽链免疫apoE缺点小鼠，可降低60%AS病变形成，并特异性增加IgG抗体水平[7]。ArteriosclerThrombVascBiol.;23:879-884.

InhibitionofAtherosclerosisinApoE-NullMicebyImmunizationwithApoB-100PeptideSequences-8-1518动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第18页斑块内OxLDL可影响DC成熟和活化，氧化过程产生溶血磷脂酰胆碱（LPC）可直接经过G蛋白偶联受体路径诱导DC成熟。oxLDL还能够增加DC表面呈递抗原以及协同信号分子表示。TheJournalofImmunology,,169:1688–1695.MatureDendriticCellGenerationPromotedbyLysophosphatidylcholine-8-1519动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第19页3.热休克蛋白HSP可与各种抗原肽结合产生免疫原性，诱导抗原特异性免疫反应。Berberian最先报道在人类和兔斑块中存在HSP70，而且HSP分布与斑块中细胞坏死、脂质聚集相关。Kleindienst研究表明颈动脉内皮细胞、平滑肌细胞和单核细胞HSP60表示量与AS严重程度呈正相关。斑块中大量存在T淋巴细胞对HSP60/65可发生特异性反应。临床研究也表明HSP60抗体与冠状动脉疾病严重程度相关，是冠脉临床事件发生主要危险原因。]ArteriosclerThrombVascBiol.;22:1547-1559.

RoleofHeatShockProteinsinAtherosclerosis-8-1520动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第20页微生物HSP65/60和人HSP60抗体之间存在交叉反应，抗微生物HSP65/60抗体能够引发本身免疫反应。除了广泛关注肺炎衣原体和巨细胞病毒编码HSP60与人HSP60分子模拟作用。除上述交叉反应引发免疫反应外，HSP可被TLR4识别经过天然免疫在AS发生中发挥关键作用。ArteriosclerThrombVascBiol.;22:1547-1559.

RoleofHeatShockProteinsinAtherosclerosis-8-1521动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第21页4.β2糖蛋白I

β2糖蛋白Ⅰ是一个含326个氨基酸血浆蛋白，主要合成部位在肝脏，普通以游离形式存在于血浆，少许与脂质结合。β2GpI是抗磷脂综合症（APS）主要抗原。各种炎症性疾病，包含AS、狼疮、APS血浆中都能检测到抗β2GpI抗体，人AS斑块内也检测到β2GPI。

DOMAINSTRUCTUREOFβ2-GLYCOPROTEINI-8-1522动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第22页George用人β2GpI免疫LDLR-/-鼠，抗β2GpI抗体显著增高，血管内皮下较多CD4+T细胞浸润，AS斑块形成显著加紧。用β2GpI免疫apoE-/-鼠也一样显示斑块形成速度加紧，抗β2GpI抗体水平增高。Circulation.1998;98:1108-1115.

InductionofEarlyAtherosclerosisinLDL-Receptor–DeficientMiceImmunizedWithb2-GlycoproteinI-8-1523动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第23页用β2GpI免疫普通小鼠，再将其淋巴结和脾脏处淋巴细胞注入LDLR-/-小鼠腹腔，发觉LDLR-/-小鼠早期AS斑块增加。说明β2GpI经过淋巴细胞在动脉粥样硬化形成中发挥作用。Circulation.;102:1822-1827.

AdoptiveTransferofb2-GlycoproteinI–ReactiveLymphocytesEnhancesEarlyAtherosclerosisinLDLReceptor–DeficientMice-8-1524动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第24页四、AS与天然免疫天然免疫是机体第一道防线，它经过天然免疫效应细胞和效应分子发挥作用。天然免疫效应细胞包含单核/巨噬细胞、NK细胞，树突状细胞、肥大细胞、B1细胞等；天然免疫效应分子则有炎症介质、补体等。单核/巨噬细胞在AS发病中含有主要地位，其它效应细胞一样可能发挥一定作用。-8-1525动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第25页Kristina用半定量PCR和免疫组化方法发觉，人AS斑块中TLR1、TLR2、TLR4表示显著增加，同时也伴随有NF-κB表示。推测TLRs在斑块炎症活化过程中天然免疫机制发挥作用。Circulation.;105:1158-1161.

ExpressionofToll-LikeReceptorsinHumanAtheroscleroticLesions:APossiblePathwayforPlaqueActivation

-8-1526动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第26页

TLR信号转导

TLR和PAPMs结合后形成二聚体,随即转接蛋白MyD88经过C末端Toll/IL-1R（TIR）结构域与TLR胞内段相互作用，介导LPS诱导单核细胞或内皮细胞NF-κB活化，激活细胞因子基因转录，介导共刺激信号B7分子表示，进而经过APC而活化Ｔ细胞。TLR细胞内信号传导分子MyD88参加AS进程。MyD88缺乏可使斑块面积缩小，脂质成份降低，促炎介质以及细胞因子和趋化因子如IL-12和MCP-1表示降低。-8-1527动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第27页Frank分别以野生型牙龈卟啉单胞菌和毒性减弱牙龈卟啉单胞菌菌毛缺失突变体(FimA-)感染apoE-/-小鼠。感染野生型牙龈卟啉单胞菌apoE-/-小鼠AS斑块增加，主动脉壁TLR2和TLR4表示上调；而后者尽管在apoE-/-小鼠血液和主动脉弓组织内检测到FimA-突变株存在，不过没有出现TLRs表示上调，斑块病变无显著进展；提醒由TLRs介导天然免疫在AS发展中发挥主要作用。Circulation.;109:2801-2806.)InnateImmuneRecognitionofInvasiveBacteriaAcceleratesAtherosclerosisinApolipoproteinE–DeficientMice-8-1528动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第28页清道夫受体巨噬细胞清道夫受体在生物学方面最新进展是发觉，它既能识别感染性非本身物质（病原体），又能识别修饰后本身物质(凋亡样细胞和修饰后LDL)，是模式识别受体家族中一员。

AS斑块内巨噬细胞表示大量清道夫受体。尤其是SR-A，在天然免疫，凋亡样细胞去除，以及组织自稳态方面也发挥着主要作用。-8-1529动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第29页SR-A1转基因鼠

转SR-A1C57BL/6小鼠喂养高脂饲料24周后，主动脉瓣膜附着处血管壁增厚，显著粘液样变性，冠脉内膜增厚，泡沫细胞聚集、中膜粘液样变性；主动脉苏丹Ⅳ染色表明有显著脂纹形成。-8-1530动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第30页ControlgrouptransgenicgroupTransgenichighcholesterolgroupHighcholesterolgroup-8-1531动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第31页小鼠主动脉粥样硬化斑块

-8-1532动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第32页SR-AⅠ对ox-LDL诱导TPH-1细胞MMP-9表示影响

明胶酶谱MMP-9活性1：对照2：OX-LDL3：OX-LDL+SR-AⅠ正义寡核苷酸4：OX-LDL+SR-AⅠ反义寡核苷酸5：OX-LDL+SR-AⅠ抗体12354-8-1533动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第33页SR-AⅠ对ox-LDL诱导TPH-1细胞MMP-2活性影响-8-1534动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第34页SR-Ⅰ对ox-LDL诱导TPH-1细胞TIMP-1表示影响

TIMP-1WesternBlot

1：对照2：OX-LDL3：OX-LDL+SR-AⅠ正义寡核苷酸4：OX-LDL+SR-AⅠ反义寡核苷酸5：OX-LDL+SR-AⅠ抗体12345-8-1535动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第35页肥大细胞肥大细胞表示Fcγ-RⅠ，Fcγ-RⅢ，TLR-2，TLR-4，作为微环境感应细胞在天然免疫和取得性免疫都起直接作用。外源凝集素、补体活化产物C5a、C3a等各种刺激物均可经过Fcγ-Ⅰ激活肥大细胞。促进肥大细胞脱颗粒。活化肥大细胞脱颗粒释放大量生物活性物质，包含血管活性物质、中性蛋白酶、炎症因子和生长因子等，促进AS病变形成和破裂。-8-1536动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第36页Circulation.1996;94:2787-2792.)MastCellsinRupture-ProneAreasofHumanCoronaryAtheromasProduceandStoreTNF-α-8-1537动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第37页

对照组ox-LDL(48h)透射电镜甲苯胺蓝

染色-8-1538动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第38页对照组试验组主动脉病变HE染色试验组主动脉甲苯胺蓝染色Compound48/80对apoE基因敲除鼠主动脉斑快影响-8-1539动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第39页即使NK细胞存在于斑块处直接证据极少，但最近报道NK细胞功效抑制时，LDLR-/-小鼠体内AS病变降低，NK细胞可能有致AS作用。

ArteriosclerThrombVascBiol.;24:1049-1054.DepletionofNaturalKillerCellFunctionDecreasesAtherosclerosisinLow-DensityLipoproteinReceptorNullMice-8-1540动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第40页五、AS与抗原呈递细胞

APC在连接天然免疫和取得性免疫中起桥梁作用，它能摄取、加工、处理抗原并将抗原信息呈递给淋巴细胞，促使特异性淋巴细胞活化，产生取得性免疫应答。巨噬细胞、树突状细胞、B淋巴细胞是专职抗原呈递细胞，内皮细胞、成纤维细胞、上皮及间皮细胞等抗原呈递作用较弱，为非专职性抗原呈递细胞。

-8-1541动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第41页

取得性免疫应答需要双信号开启，即特异性抗原刺激和来自抗原递呈细胞共刺激信号，这些信号多要APC尤其走DC提供。APC经过其PRR模式识别作用内在化病原体，并将其加工成MHC：肽复合物，之后递呈给Th细胞，而且只有在将某一物质识别为有害物后才表示共刺激信号Ｂ7分子。

-8-1542动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第42页人和鼠AS斑块均可检测到DC，而且DC与T淋巴细胞同时存在于易破裂斑块肩部。DC还可能经过抗原呈递作用刺激T淋巴细胞活化，影响斑块稳定性。DC在摄取微环境中抗原后深入分化成熟，促进T淋巴细胞活化，激活取得性免疫反应。JPathol.Dec;198(4):511-6.HumanatheroscleroticplaquesexpressDC-SIGN,anovelproteinfoundondendriticcellsandmacrophages.-8-1543动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第43页六、AS与取得性免疫-8-1544动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第44页Zhou等将apoE-/-鼠与scid/scid免疫缺点小鼠杂交其后代小鼠大动脉斑块面积与apoE-/-鼠相比降低73％，而将apoE-/-鼠CD4＋T细胞移植到apoE-/-/scid/scid小鼠体内，斑块增加164％。

Circulation.;102:2919-2922.TransferofCD41TCellsAggravatesAtherosclerosisinImmunodeficientApolipoproteinEKnockoutMice-8-1545动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第45页七、AS临床事件与免疫反应

免疫细胞在斑块部位聚集，提醒免疫在AS发展和转归中起作用。Yuri发觉，NKT细胞和DC在AS斑块肩部聚集，CD1+NKT细胞参加AS斑块破裂，推测NKT细胞和DC间存在直接联络，共同参加AS斑块破裂过程。JHistochemCytochem.Jun;53(6):781-5.Co-accumulationofdendriticcellsandnaturalkillerTcellswithinrupture-proneregionsinhumanatheroscleroticplaques.-8-1546动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第46页而INF-γ抑制胶原合成，抑制SMCs增殖，还能够与TNF-α和IL-1一起促进SMCs凋亡，使纤维帽变薄，易于破裂。免疫介质可经过调整基质金属蛋白酶、组织蛋白酶和肥大细胞蛋白水解酶可降解纤维帽胶原释放影响斑块稳定。

-8-1547动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第47页人AS晚期病变中T细胞数量占细胞总数10％到20％，同时表示CD3、CD4和T细胞抗原受体（TCRαβ+）T细胞占全部CD3+T细胞百分比高达2/3（在apoE-/-鼠中可超出90％）。AS大部分临床并发症都包括血栓形成，T细胞在AS斑块破裂处聚集可引发致命性动脉粥样血栓形成。先天性免疫介质可影响血栓形成一些步骤，组织因子（TF）是动脉粥样血栓形成主要因子，LPS、TNF-α、IL-1、INF-γ和PTX-3都可诱导人ECs表示TF，CD40L可诱导单核巨噬细胞表示TF。-8-1548动脉粥样硬化免疫机制的研究进展第48页而在动脉粥样瘤内Mφ、Ecs、SMCs和活化血小板都能够表示CD40L[42]。可溶性细胞因子如