乳制品中金黄色葡萄球菌检测

乳制品中金黄色葡萄球菌检测生物学特性

---菌体形态及培养特征革兰氏阳性球菌，直径为0.8-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群；无芽孢，不运动；兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；可在15%氯化钠和40%胆汁中生长生物学特性

---菌体形态及培养特征大多数菌株能生长在6.5-46℃之间（最适温度30-37℃）能在pH4.2-9.3之间生长（最适pH为7.0-7.5）；大多数菌株产生类胡罗卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，而且在单个菌株中可能也有变化生物学特性

---菌体形态及培养特征好氧生长的细胞产生接触酶；产生蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和溶菌酶，大多数菌株可水解天然的动物蛋白，例如血红蛋白、纤维蛋白、卵白、酪朊和多肽类如明胶，水解脂类、吐温类和磷脂蛋白质，并释放脂肪酸；所有的毒株产生凝固酶，人和动物来源的菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。致病性金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：

a.溶血素：外毒素，分α、β、γ、δ四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；

b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；

c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；

d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；

e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E五种。致病性金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。致病性葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可相当数量的肠毒素。分布在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。传播媒介为被该菌污染的食品，主要为淀粉类(如剩饭、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及鱼、肉、蛋类等。被污染的食物在室温20℃-22℃放置5小时以上时，病菌大量繁殖，并产生肠毒素。葡萄球菌皮肤感染流行病学季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。流行病学金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。流行病学肠毒素形成条件：存放温度，在37°C内，温度越高，产毒时间越短；存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素；食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。耐受力几乎所有的消毒试剂以及热加工过程对金黄色葡萄球菌都有严重的破坏作用肠毒素可耐受100℃30分钟不被破坏。对于加工过的食品或食品加工设备而言，此菌或其肠毒素的存在通常作为卫生条件差的一种指标。污染的控制防止金黄色葡萄球菌污染食品

防止带菌人群对各种食物的污染：定期对生产加工人员进行健康检查，患局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止其工作或调换岗位。污染的控制防止金黄色葡萄球菌污染食品

防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染：如牛奶厂要定期检查奶牛的乳房，不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶；奶挤出后，要迅速冷至-10℃以下，以防毒素生成、细菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶为原料，注意低温保存。污染的控制防止金黄色葡萄球菌污染食品

对肉制品加工厂，患局部化脓感染的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温或其他适当方式处理后进行加工生产。污染的控制防止金黄色葡萄球菌肠毒素的生成

应在低温和通风良好的条件下贮藏食物，以防肠毒素形成；在气温高的春夏季，食物置冷藏或通风阴凉地方也不应超过6小时，并且食用前要彻底加热。检测步骤

---增菌利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性（可耐受15%的氯化钠），用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤增菌。检测步骤

---分离血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血平板上产生明显的溶血环。血平板上其典型菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血圈。检测步骤

---分离BP平板：胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、维生素和痕量矿物元素丙酮酸钠是一种生长促进剂亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有毒性，并使菌落产生黑色卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。检测步骤

---分离在BP平板上其典型菌落为：圆形，光滑突起，湿润，直径2-3mm，颜色呈灰色到黑玉色，边缘常为淡色（米黄色或灰白色略带灰色或黄色的白色），周围为一混浊带，在其外缘常有一透明圈。用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。偶然会遇到不分解脂肪菌株，除无混浊带及透明圈外，其他外观基本相同。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落，其黑色常较典型菌落淡些，且外观可能粗燥，质地较干燥。B-P平板检测步骤

---鉴定金黄色葡萄球菌可以产生凝固酶，因此对其鉴别的主要实验是测定其凝固酶。对于凝固不完全的菌株，可以通过一些其他实验来进一步确认，例如：厌氧葡萄糖发酵、溶葡萄球菌酶敏感性实验、耐热核酸酶实验等。所有这些实验不能作为鉴别其产毒与否的依据。25g样品+225ml生理盐水

5mL样品匀液（1:10）+50mL胰酪胨大豆肉汤血平板36±1℃

24hr

镜检营养肉汤血浆凝固酶实验报告结果定性检测36±1℃

24hr

36±1℃

24hr

36±1℃6hr

BP平板75g/L氯化钠肉汤25g样品+225ml生理盐水

选三个连续梯度，每个梯度各取3mL加入3管胰酪胨大豆肉汤将有生长的管划线接种36±1℃

48hr

镜检营养肉汤血浆凝固酶实验报告结果MPN/g(mL)定量检测（MPN法）36±1℃

48hr

36±1℃

24hr

36±1℃

6hr

适用于检测可能含有少量金黄色葡萄球菌，却带有大量竞争菌的样品梯度稀释25g样品+225ml生理盐水

选三个连续梯度，每个梯度分别取1mL接种之至表面干燥的BP平板（如0.4mL，0.3mL，0.3mL）平板计数（分别记录每种类型的菌落数）36±1℃

48hr

镜检营养肉汤血浆凝固酶实验报告结果金葡菌数/g(mL)定量检测（平板法）每种类型至少选取一个菌落36±1℃

24hr

36±1℃

6hr

适用于检测金黄色葡萄球菌数不小于10/g（mL）的食品梯度稀释3M™Petrifilm™

金黄色葡萄球菌快速检验法的检验程序第一法金黄色葡萄球菌定性检验第二法金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计数

第三法金黄色葡萄球菌MPN计数一、实验目的要求了解食品的质量与金黄色葡萄球菌检验的意义。掌握金黄色葡萄球菌的生物学特性。掌握金黄色葡萄球菌检验的生化试验的操作方法和结果的判断。掌握食品中金黄色葡萄球菌检验的方法和技术。二、原理葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。三、试剂和仪器（一）最先准备的器材规格名称 数量 用途1、500ml三角瓶 1个 7.5%氯化钠肉汤2、500ml三角瓶 1个 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤3、250ml三角瓶 4个 制血培养基等4、10×100mm试管 6支 血浆凝固酶试验5、1ml移液管 2支6、10ml移液管 2支7、直径为90mm平皿12套 制血平板、B-P平板8、250ml量筒 1支（二）应灭菌的其它器材剪刀1把 不锈钢汤匙1把称量纸适量（三）应制备的培养基培养基总量 所用容器7.5%氯化钠肉汤 225ml/瓶1瓶 500ml三角瓶10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤225ml/瓶1瓶500ml三角瓶血琼脂 100ml/瓶1瓶 250ml三角瓶B—P培养基 95ml/瓶1瓶 250ml三角瓶兔血液 5mlA.110%氯化钠胰酪胨大豆肉汤A.1.1成分胰酪胨（或胰蛋白胨）17.0g植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）3.0g氯化钠100.0g磷酸氢二钾2.5g丙酮酸钠10.0g葡萄糖2.5g蒸馏水1000mLpH7.3±0.2A.1.2制法将上述成分混合，加热，轻轻搅拌并溶解，调节pH，分装，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。A.27.5%氯化钠肉汤

A.2.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化钠75g蒸馏水1000mLpH7.4A.2.2制法将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。A.3血琼脂平板A.3.1成分：豆粉琼脂（pH7.4～7.6）100mL脱纤维羊血（或兔血）5mL～10mLA.3.2制法：加热溶化琼脂，冷却至50℃，以无菌操作加入脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。血琼脂平板：蛋白胨10g牛肉膏5g氯化钠5g琼脂10~20g蒸馏水1000ml

煮沸至充分溶解，高压灭菌15~20min待冷却至50℃左右时加入50ml抗凝羊血（除去纤维）或兔血。摇匀或搅匀倒平板或试管斜面。温度过高，培养基呈棕褐色；温度过低则不利于血液与培养基混匀。A.4Baird－Parker琼脂平板A.4.1成分胰蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g酵母膏1.0g丙酮酸钠10.0g甘氨酸12.0g氯化锂（LiCl·6H2O）5.0g琼脂20.0g蒸馏水950mLpH7.0±0.2A.4.2增菌剂的配法30%卵黄盐水50mL与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL混合，保存于冰箱内。A.4.3制法将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH。分装每瓶95mL，121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。称取本品63克,加入950ml蒸馏水中,加热煮沸溶解，分装,121℃高压灭菌15分钟备用。冷至50℃，每95ml加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌液(04-025)配套试剂（用法与用量见配套试剂说明）。摇匀后倾注平皿。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h）四、实验内容

（一）、增菌培养法样品处理→→选择性增菌→→选择性平板分离→→血浆凝固酶试验鉴别→→结果报告第一天样品处理和增菌培养（一）、样品处理固体或半固体食品：以无菌操作称取25g样品，放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1～2min，制成1:10样品匀液。

液体食品:：用灭菌吸管吸取25mL样品，放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇制成1:10样品匀液。（二）、增菌培养接种操作：吸取5mL稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中。37°C培养24小时。培养：放于36±1℃培养24h。培养结果：在NaCl肉汤中呈混浊生长，胰蛋白胨肉汤中有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长。第二天接种选择性平板进行分离培养（一）、接种选择性平板取增菌液1环，划线接种于血平板或B－P平板。（二）、培养放于36±1℃培养24h。第三天观察分离结果、镜检、做血浆凝固酶试验（一）、观察分离结果结果：金黄色葡萄球菌，在血平板上呈：金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈；在Baird-Parker平板上：菌落为圆形，直径2-3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带，在其外层有一透明圈。（二）、革兰氏染色、镜检操作：革兰氏染色→镜检结果：金黄色葡萄球菌，革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞，直径0.5-1μm。（三）、结果报告：综合形态特征，血平板情况以及血浆凝固酶试验结果，判别检样有否金黄色葡萄球菌作出报告。金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验取肉汤培养物0.5mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆于试管内充分混合,置36±1℃培养,定时观察是否有凝块形成,至少观察6h,以内容物完全凝固,使试管倒置或倾斜时不流动者为阳性。1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照，另1支加入营养肉汤或0.9％无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性对照。

阳性和阴性对照血浆凝固酶试验(1)取洁净玻片一张，于两端各加兔血浆一滴。(2)用接种环取金黄色葡萄球菌苔一环，在玻片一端兔血浆中研磨混匀，接种环灭菌后再取白色葡萄球菌苔一环，在另一端兔血浆中研磨均匀。(3)观察兔血浆有无凝集现象。四.检验和控制

1．金黄色葡萄球菌的检验

样品处理：无菌取25g或25mL食品样品，放入225mL灭菌生理盐水中均质，制成10-1稀释液。

增菌培养：将10-1稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，37°C培养24小时。

分离培养：将上述稀释液或培养液分别划线血平板和Baird-Parker平板，置37°C培养24-48小时。金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌落为圆形，直径2-3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带。

染色观察：从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞、荚膜，直径0.5-1μm。

血浆凝固酶试验：吸取0.5mL兔血浆与0.5mL金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤24小时培养物充分混匀，置36±1°C培养，每隔半小时观察一次，连续观察6小时，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。

耐热核酸酶试验：将24小时肉汤培养物沸水浴处理15min，用接种环划线刺种于甲苯胺兰-DNA平板，36±1°C培养24小时，在刺种线周围出现淡粉色者为阳性。本试验金黄色葡萄球菌为阳性。

2．金黄色葡萄球菌肠毒素检测

样品处理：无菌取25g或25mL食品样品，放入225mL灭菌生理盐水中均质，制成10-1稀释液。增菌培养：将10-1稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，37°C培养24