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文档简介
免疫球蛋白免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。抗体(antibody,Ab)是B细胞识别抗原后增殖分化为桨细胞所产生的一种蛋白质,主要存在于血清等体液中,能与相应抗原特异性地结合,具有免疫功能.与抗体有关的诺贝尔奖获得者1901vonBering血清治疗1908Ehrlich&Metchnikoff抗体生成、吞噬1972Edelman&Poter抗体分子结构1977Yalow放射免疫测定1984Koler,Milstein&Jerne单克隆抗体1987TonegawaIg基因结构免疫球蛋白与抗体的关系所有的抗体都是免疫球蛋白,但并非所有的免疫球蛋白都是抗体。免疫球蛋白是结构和化学上的概念,抗体是生物学和功能上的概念。Ig可分为二类:分泌型(secretedIg,sIg):存在于体液(血清、组织液,外分泌液)。膜型(membraneIg,mIg):即B细胞膜上的抗原受体。第一节免疫球蛋白的结构一、免疫球蛋白的基本结构四肽链结构所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构。两条重链(H)和两条轻链(L)。每条重链和轻链分为氨基端和羧基端。人类Ig根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同,分为五类:IgG、IgA、IgM、IgD、IgE,其重链分别为:γ、α、μ、δ、ε轻链可分为两型:κ、λ型Ig的两条长链称为重链(Heavychain,H链)
重链可分为μ、γ、α、δ、ε链
Ig的两条短链称为轻链(Lightchain,L链)可分为κ、λ型。每个Ig分子的两条轻链完全相同。
IgMIgGIgAIgDIgE可变区根据氨基酸排列顺序的不同分为可变区(V)和恒定区(C)。比较不同抗体V区的氨基酸序列,发现VH和VL各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序特别易变化,这些区域称为高变区。三个高变区共同组成Ig的抗原结合部位,该部位也称为互补性决定区.恒定区重链和轻链的C区分别称为CH和CL,不同类Ig的重链CH长度不一,同一种属动物中,同一类别Ig分子C区氨基酸的组成和排列顺序比较恒定。铰链区位于CH1与CH2之间,含有丰富的脯氨酸,因此易伸展弯曲,而且易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解。免疫球蛋白的结构高变区二、免疫球蛋白的功能区每个功能区约由110个氨基酸组成,其氨基酸的序列具有相似形或同源性。其二级结构是反向平行的β片层IgG,IgA,IgD:Lchain:VL,CLHchain:VH,CH1,CH2,CH3IgM,IgE:Lchain:VL,CLHchain:VH,CH1,CH2,CH3,CH4功能区的作用VL,VH:超变区,互补决定区(CDR):与抗原特异性结合部位CL,CH1:同种异型的遗传标记CH2,CH3(IgM):补体C1q结合点,激活补体IgGCH2:通过胎盘IgGCH3:与单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、
NK细胞、B细胞表面的Fc
R结合。IgECH2和CH3:与肥大细胞和嗜碱性性粒细胞表面的IgEFc结合铰链区:适于V区同抗原的结合。含大量脯氨酸,富有弹性和伸展性,能使Ab与不同距离的抗原决定簇结合,也利于暴露补体结合位点。三、免疫球蛋白的水解片段木瓜蛋白酶水解IgG
得到两个相同的Fab段和一个Fc段。胃蛋白酶裂解IgG
得到一个具有双价活性的F(ab’)2段和若干个小分子多肽碎片(pFc’)
四、J链和分泌片(一)连接链(J链)由浆细胞合成的一种糖蛋白。
IgA和IgM含有J链可稳定Ig多聚体的成份(二)分泌片是分泌型IgA(sIgA)的一个辅助成分,由粘膜上皮细胞合成和分泌。保护sIgA的铰链区免受蛋白酶的水解破坏介导IgA二聚体的转运第二节免疫球蛋白的功能V区的功能:
主要功能是识别和特异性的结合抗原,是V区特别是HVR(CDR)的空间构型所决定Ig单体可结合两个抗原表位,为双价
Ab+Ag——发挥免疫效应
B细胞膜表面的IgM和IgD是B细胞识别抗原的受体C区的功能:☆激活补体IgM,IgG1~3+Ag☆结合细胞表面的Fc受体调理作用、ADCC作用、介导I型超敏反应☆穿过胎盘和黏膜BACK或其它大分子细菌代谢产物抗原细菌1.抗原抗体复合物2.结合细胞调理吞噬作用肥大细胞脱颗粒4.炎症反映3.激活补体介导杀伤抗独特型抗体
抗体的抗原结合部位(antigenbindingsite)是抗原三维结构的“映象”。抗体的这一独特氨基酸结构称为独特型(idiotype)。
将某一抗体注射到另一个动物体内,可产生这一抗体的抗独特型的抗体(anti-ids)。这一抗体“模仿”了抗原三维结构,可被用于作为疫苗。
把抗独特型的抗体作为疫苗注入人体,可产生抗-抗独特型的抗体(anti-anti-idiotypeantiobodies),它识别的结构与病毒(抗原)的结构相似,具有潜在的中和病毒的可能性。即:对乙型肝炎表面抗原(hepatitisBSantigen)反应的抗体的抗独特型抗体可激发抗病毒的抗体。IgG于出生后3个月开始合成IgG为单体,半衰期约23天,血清含量最高,占血清免疫球蛋白总量的75%,是血清中主要的抗感染抗体。IgG1、IgG2和IgG3的CH2能通过经典途径激活补体。一、IgG第三节五类Ig的特性与功能IgG是唯一能通过胎盘的抗体通过Fc段与吞噬细胞表面FcR结合,发挥调理作用;与NK细胞结合,发挥ADCC作用;与葡萄球菌A蛋白结合,可用于免疫学诊断和IgG抗体的纯化。具有抗菌、抗毒素和抗病毒作用参与Ⅱ、Ⅲ型超敏反应二、IgM五聚体,是分子量最大的Ig,又称为巨球蛋白。个体发育过程最早产生的抗体,胚胎晚期开始合成,新生儿脐带血中IgM水平升高,提示胎儿曾有宫内感染。IgM激活补体能力比IgG强天然血型抗体IgM在早期免疫防御过程发挥重要作用,是血液中抗感染的主要抗体。IgM是抗原刺激后出现最早的抗体,故检测IgM水平可用于传染病的早期诊断。膜IgM是B细胞抗原受体的主要成分参与Ⅱ、Ⅲ型超敏反应
J链
IgM的结构IgMJ链两种IgM的比较分泌型IgM膜型IgMmIgMIgaIgbIgaIgbmeB细胞表面IgM分泌型IgA(双体)血清型IgA(单体)分泌型IgA(sIgA,双体)sIgA是局部和粘膜免疫的主要IgJchainSC四、IgDIgD是B细胞的重要表面标志未成熟B细胞仅表达mIgM成熟B细胞同时表达mIgM和mIgD活化B细胞或记忆B细胞表面的mIgD逐渐消失膜型IgD是B细胞表面的抗原受体(BCR)
IgD分子的结构五、IgE又称亲细胞抗体CH2和CH3功能区可与肥大细胞、嗜碱性粒细胞上的高亲和力Fcε受体(FcεR1)结合,引起I型超敏反应。第四节单克隆抗体和多克隆抗体多克隆抗体
用抗原免疫动物后获得的免疫血清(抗血清)由不同克隆的B细胞针对不同抗原决定簇所产生。多克隆抗体多个抗原决定基——机体——多种抗体的混合物单克隆抗体(monoclonalantibody)为只针对某一特定的抗原决定基,纯度高的抗体
二单克隆抗体单克隆抗体概念:每一克隆B细胞所产生的理化性状高度均一、组成均一、只与同一种抗原决定族反应的抗体,称为单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)。杂交瘤技术制备单克隆抗体流程动物免疫分离脾细胞制备骨髓瘤细胞细胞融合HAT培养基选择杂交瘤细胞阳性孔克隆化并扩大培养再次克隆克隆扩大培养扩大培养收集上清液动物接种收集腹水单克隆抗体纯化保存ELISA测血清单克隆抗体的基本技术1.抗原提纯与动物免疫:抗原纯度高:电泳纯与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠2.细胞的选择:
A经过抗原免疫的B细胞(脾细胞)。
B肿瘤细胞(多发性骨髓瘤细胞:Sp2/0)。3.细胞融合:融合剂:聚乙二醇
(PEG,常用聚合度1000~2000浓度w/v:40%)
细胞比例:1:2~1:10,常用1:4。反应时间:2~4min。4.培养基的选择:HAT培养基。含有三种关键成分:次黄嘌呤(hypoxanthine,H)氨甲蝶呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T).5.细胞的DNA合成一般有两条途径:A:由糖和氨基酸合成核苷酸,进而合成DNA,叶酸作为重要的辅酶参与反应。B:在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在下,经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化下合成DNA。6.HAT培养基的选择原理:⑴氨甲蝶呤(A)是叶酸拮抗剂,可阻断细胞利用正常途径合成DNA,细胞在含有氨甲蝶呤的培养基中不能通过正常途径合成DNA。⑵瘤细胞是HGPRT酶阴性细胞,自身不能通过替代途径合成DNA而繁殖。⑶B细胞虽含有HGPRT,但不能在体外培养存活(只存活5~7d,且功能下降)。⑷融合细胞含有B细胞和瘤细胞,其中瘤细胞核利用B细胞的HGPRT酶进行旁路合成DNA而存活。7.克隆化并扩大培养(单细胞培养称为克隆化):⑴有限稀释法:将细胞悬液逐次稀释后加入培养孔(36%的孔为1个细胞/孔),可获得单个细胞形成的克隆,选择高分泌抗体的细胞株扩大培养或冻存。⑵显微操作法:在倒置显微镜下吸出单个细胞培养。⑶软琼脂平板法:下饲养/上融合C,分层培养后用⑵法⑷细胞分选仪法:流式细胞仪分选。8.单克隆抗体的制备、纯化:A体外细胞株扩大培养,取上清液提纯。B接种小鼠腹腔,取腹水提纯。C纯化按抗体纯化步骤进行。9.细胞株冻存和复苏:加小牛血清或1640培养液配成终浓度10%的二甲亚砜(DMSO)冻存液后液氮(-196℃)保存。原则是:慢冻(逐步降温,以每分钟降1℃为宜),快融(立即浸入37~40℃水浴)。10.注意事项:⑴用降植烷(pristane)等油类制剂,反复注入BALB/C小鼠腹强腔,可诱发产生小鼠骨髓瘤细胞。这种细胞在适宜培养条件下,具有无限繁殖能力,选择本身不会产生Ig(SP2/O和小鼠骨髓瘤653细胞株)的对数期生长细胞作为融合细胞。⑵选择缺乏HGPRT或TK的细胞:
A采用毒性药物8-氮鸟嘌呤(8-azaguanine,8-AG)选育出缺乏HGPRT的细胞(因为HGPRT+细胞利用8-AG后合成毒性核苷酸而死亡,只有HGPRT-细胞才能存活),培
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