精细陶瓷 室内照明环境下半导体光催化材料抗病毒活性的测定 Q-β噬菌体测试法 征求意见稿

4GB/TXXXXX—XXXX/ISO18071:2016精细陶瓷室内照明环境下半导体光催化材料抗病毒活性的测定Q-β噬菌体测试法警示——经过微生物技术培训的人员才宜进行本方法的试验。本文件规定了含有室内光照活性催化剂或表面有室内光照活性催化膜的材料的抗病毒活性的测试方法，本方法通过计数经室内光照之后的Q-β噬菌体的减少来确定其抗病毒活性。注：在试验方法中，Q-β噬菌体代表流感病毒作为试验微生物。本文件适用于建材领域不同种类的室内光催化材料，如板材、片材、平板材料等。本文件不适用于粉末，颗粒或多孔室内光激发的光催化材料。本文件适用于具有抗病毒性能的室内光催化材料，不适用于其他用途如抗细菌性能、抗真菌性能、水中污染物降解、自清洁、防雾和空气净化性能的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ISO14605精细陶瓷(先进陶瓷，先进技术陶瓷)室内光照环境下测试半导体光催化材料用光源[Fineceramics(advancedceramics,advancedtechnicalceramics)—Lightsourcefortestingsemiconductingphotocatalyticmaterialsusedunderindoorlightingenvironment]ISO27447精细陶瓷(先进陶瓷、先进技术陶瓷)半导体光催化材料抗菌活性的试验方法[Fineceramics(advancedceramics,advancedtechnicalceramics)—Testmethodforantibacterialactivityofsemiconductingphotocatalyticmaterials]ISO80000-1量和单位第1部分：总则（Quantitiesandunits—Part1:General）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1光催化剂photocatalyst在一定光源激发下，能产生催化作用的物质。由光照激发、基于氧化和还原反应的产生相关功能的物质。这些功能包括分解和去除空气和水污染物、除臭、抗菌、抗真菌、自清洁和防雾作用。3.2室内光活性催化剂indoor-light-activephotocatalyst由普通照明用人工光源（如室内照明环境）激发的光催化剂。3.3室内光照环境indoorlightingenvironment采用人工光源进行普通照明的环境。5GB/TXXXXX—XXXX/ISO18071:20163.4室内光催化材料indoor-light-activephotocatalyticmaterials通过涂覆、浸泡、掺杂等方式在表面或内部添加了室内光活性催化剂的材料。3.5抗病毒antiviral降低材料表面病毒侵染活性的能力。3.6噬菌体bacteriophage可以感染细菌的一类病毒。3.7噬菌斑plaque由单个噬菌体侵染并裂解宿主细胞形成的清晰可见的区域。3.8室内光活性催化抗病毒活性值indoor-light-activephotocatalystantiviralactivityvalue光催化材料与未经光催化剂处理的对照材料在室内光照后得到的噬菌斑数量的对数值的差值。注：该值包含了未经室内光照时噬菌斑数量的减少。3.9室内光照条件下的室内光活性催化抗病毒活性值indoor-light-activephotocatalystantiviralactivityvalueforindoorlightillumination在室内光照射条件下光催化处理材料上噬菌斑数量的对数值与暗条件下光催化处理材料上噬菌斑数量的对数值的差值。4符号下列符号适用于本文件：A——未经处理的样品上接种后立即分离得到的噬菌体滴度的平均值；BD——未经处理的样品在暗条件下一定时间后分离得到的噬菌体滴度的平均值；BF-L——未经处理的样品在室内光照强度L下光照一定时间后分离得到的噬菌体滴度的平均值；CD——经室内光照激发的光催化剂处理的样品在暗条件下一定时间后分离得到的噬菌体滴度的平均值；CF-L——经室内光激发的光催化剂处理的样品在室内光照强度L下光照一定时间后分离得到的噬菌体滴度的平均值；DF——稀释倍数；F——紫外滤光片的型号（条件A或条件BL——室内光照度；Logmax——噬菌体滴度最大对数值；Logmean——3个未经处理的样品的噬菌体滴度对数平均值；Logmin——噬菌体滴度最小对数值；N——噬菌体滴度（噬菌斑形成单位）；VD——不含室内光照活性催化剂的样品在暗条件下一定时间后的抗病毒活性值；6GB/TXXXXX—XXXX/ISO18071:2016VF-L——室内光照激发的光催化材料样品在光照强度F-L光照一定时间后的室内光激发光催化剂抗病毒活性值；ΔV——室内光激发的光催化剂室内光贡献的抗病毒活性值；Z——两个平板上噬菌斑数量的平均值。5原理该试验方法通过将片状、块状或平板状材料类的试样与噬菌体接触并置于室内光下照射，从而获得光催化材料的抗病毒活性值。该测试方法适用于室内光活性催化材料的开发、性能比对、质量保证、表征、可靠性及设计。该方法是将试样置于室内光照射下与噬菌体接触来获得室内光激发的光催化材料的抗病毒活性。该方法适用于片材、板材或平板状材料。在室内光激发的光催化处理的试样上接种噬菌体悬液，然后暴露在光下照射一定时间。光照结束后，洗脱试样上的试验噬菌体悬液，用Q-β噬菌体的敏感宿主大肠杆菌测定洗脱液的噬菌斑形成单位。将未经光催化剂处理的材料和光催化材料在经过室内光照强度照射后得到的结果以及未经光催化处理的材料和光催化处理的材料在暗条件下相同时间得到的结果进行比较。注：本文件试验方法参考了GB/T42439[1]并进行了修改。即，采用相同的无光源尺寸、相似的操作步骤和计算方法。因此，建议应用本文件进行试验时参考GB/T42439[16材料6.1试验微生物和试验准备6.1.1试验微生物试验所使用的菌株应与表1中的相同或等效，宜从世界菌种保藏联合会(WFCC)成员机构获得。微生物的无菌操作应在合适的生物安全柜中进行。表1试验用的噬菌体和宿主菌ATCC23631-B1NBRC20012注：ATCC23631-B1与NBRC20012并不严格一致，但是它们来源相同（见附录B）。6.1.2细菌的准备细菌准备要求如下：a)将大肠杆菌接种到斜面培养基上[6mL～10mLLB琼脂（见6.2.4）]，(37±1)℃培养16h～24h，存放于在5℃~10℃冰箱内；b)一个月内可以按照上述步骤制备传代菌种；c)超过1个月的斜面培养物不应使用；7GB/TXXXXX—XXXX/ISO18071:2016d)从原代菌株开始菌种的传代次数不超过10次。注：如果细菌在超低温冰箱保存，从原代菌株开始菌种的传代次数为10次。6.1.3噬菌体的准备噬菌体准备步骤如下：a)在300mL锥形瓶中加入25mL含钙LB肉汤（见6.2.4），接种大肠杆菌；b)在（37±1）℃和（110±10）rpm条件下振荡培养（18±2）h；c)在300mL锥形瓶中加入25mLLB培养基，预热至（35～37）℃,接种0.025mLb)的培养物；d)按上述条件培养，直至细菌浓度至（2.0±1.0）×108cfu/mL。宜重复此步骤多次，以建立浊度和细菌浓度之间的关系。如果已获得充足的数据，此后可只测试浊度；e)在细菌培养物上接种Q-β噬菌体，使噬菌体的终浓度约为2×107pfu/mL[感染倍数(m.o.i.)约为f)按b）条件培养细菌4h；g)将培养物在（4±2）℃储存过夜；h)转移培养物至离心管中，并于（4±2）℃,10000g条件下离心20min；i)用移液管小心地将上清液移到无菌试管中；j)将含有噬菌体的上清液通过无菌过滤器过滤以纯化噬菌体溶液；k)测定噬菌体储备液的滴度（见9.6），并在（4±2）℃储存；l)检测是否有细菌污染。取1mL噬菌体储备液混入LB琼脂培养基（见6.2.6）上，并在(37±1)℃培养24h。如果有菌落生长则弃掉噬菌体储备液；m)噬菌体储备液的滴度应不小于1.0×1010pfu/mL，且不被污染。噬菌体悬浮液的滴度宜在1.0×1011pfu/ml以上，并可能达到1.0×1013pfu/ml。注：随着时间延长噬菌体储备液的滴度会缓慢降低。6.2培养基6.2.1通则可使用下文所列组分相同的商品培养基。制备的培养基的体积可根据所测试的试样的数量进行调整。6.2.21/500营养肉汤(1/500NB)将100mL纯水、0.3g肉汁提取物、1.0g蛋白胨、0.5g氯化钠加入到锥形瓶中，充分溶解。溶解后，取氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至7.1±0.1（25℃时）。用纯水将上述溶液稀释500倍。使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至7.0±0.2（25℃时），在（121±2）℃条件下高压蒸汽灭菌至少15min。如不立即使用，则储存于（5～10）℃,其有效期为7d。6.2.3钙溶液取100mL纯水、3.0g二水氯化钙放入锥形瓶中，充分溶解。加棉塞并高压蒸汽灭菌（见6.2.2）。制备好后，如不立即使用，则储存于（5～10）℃,其有效期为6个月。6.2.4含钙LB溶液取1000mL纯水、10.0g蛋白胨、5.0g酵母提取物和10.0g氯化钠，放入锥形瓶中，充分溶解。当各组分充分溶解后，用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至7.0±0.2（25℃时）。加棉塞并高压蒸汽灭菌（见8GB/TXXXXX—XXXX/ISO18071:20166.2.2）。高压蒸汽灭菌后，加入10mL钙溶液并混匀。制备好后，如不立即使用，则储存于（5～10）℃,其有效期为1个月。6.2.5琼脂粉使用微生物级的琼脂粉，浓度为1.5%时胶强度在400g/cm2～600g/cm2的琼脂粉。6.2.6LB琼脂取1000mL纯水、10.0g蛋白胨、5.0g酵母提取物、10.0g氯化钠及10.0g琼脂粉（见6.2.5），放入锥形瓶中，充分混匀。加热，使水能充分溶解各组分。用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7.0±0.2（25℃时）。加棉塞并高压蒸汽灭菌（见6.2.2）。制备好后，如不立即使用，则储存于（5～10）℃,其有效期为1个月。6.2.7底层琼脂平板（含钙LB琼脂）取1000mL纯水、10.0g蛋白胨、5.0g酵母提取物、10.0g氯化钠及10.0g琼脂粉（见6.2.5），放入锥时）。加棉塞并高压蒸汽灭菌（见6.2.2）。高压蒸汽灭菌后，加入10mL钙溶液并充分混匀。制备好后，在90mm直径的培养皿中注入（15～20）mL的培养基，储存于（5～10）℃备用。其有效期为14d。6.2.8上层琼脂取1000mL纯水、15.0g蛋白胨、7.5g酵母提取物、15.0g氯化钠及10.0g琼脂粉（见6.2.5），放入锥时）。加棉塞并灭菌（见6.2.2）。灭菌完毕，加入15mL钙溶液并充分混匀。制备好后，如不立即使用，则储存于（5～10）℃,其有效期为1个月。注：当重新融化上层琼脂时，在沸水中加热锥形瓶，不要高压蒸汽灭菌。6.2.9卵磷脂吐温80大豆酪蛋白营养液（SCDLP）取1000mL纯水、17.0g酪蛋白胨、3.0g大豆蛋白胨、5.0g氯化钠、2.5g磷酸氢二钾、2.5g葡萄糖、1.0g卵磷脂，放入锥形瓶中并充分溶解。加入7.0g非离子型表面活性剂（吐温80）并充分溶解。使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至7.0±0.2（25℃时）。如果需要，分装于试管中，加棉塞并灭菌（见6.2.2）。制备好后，如不立即使用，则储存于（5～10）℃,其有效期为1个月。6.2.10蛋白胨生理盐水溶液取1000mL纯水、10.0g蛋白胨、8.5g氯化钠，加入到锥形瓶中，并充分溶解。当各组分充分溶解后，使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至7.0±0.1（25℃时）。如果需要，分装于试管中，加棉塞并灭菌（见6.2.2）。制备好后，如不是立即使用，则储存于（5～10）℃,其有效期为1个月。7仪器设备7.1试验装置试验装置可以提供室内光照射来激活室内光活性光催化剂以测定室内光活性的光催化材料的抗病毒活性值。它包含了一个光源和一个装有试样的试验舱。测试装置示意图见图1。9GB/TXXXXX—XXXX/ISO18071:2016图1试验装置示意图7.2覆盖膜所用的覆盖膜应是惰性的，不吸水的，具有良好的密封性能，在380nm至780nm范围内，光学透明度超过85%薄膜应剪成（40±2）mm×（40±2）mm片状。7.3保湿玻璃板保湿玻璃由厚度小于1.1mm的玻璃组成，在380nm至780nm范围内，光学透明度超过85%，其尺寸宜能完全覆盖培养皿。7.4玻璃管或玻璃棒玻璃管或玻璃棒符合ISO27447的规定。宜通过将直径约为4mm～6mm的玻璃棒或玻璃管切割成10cm～15cm长度且弯成U形或V形制备。注：玻璃管或玻璃棒用于支撑培养皿中的试样。7.5滤纸宜通过将纤维滤纸裁剪成直径约85mm制备。注：根据其吸水能力，每个培养皿中需要（1～4）片圆形的纤维滤纸。7.6光源室内光照条件的光源要符合ISO14605的规定。应使用色温3800K～4500K的卤代磷酸盐荧光灯作为光源。如不能获得卤代磷酸盐荧光灯，建议使用色温3800K～4500K、显色指数（Ra）高于80的三波段荧光灯替代。7.7紫外滤光片GB/TXXXXX—XXXX/ISO18071:2016应使用ISO14605规定的紫外滤光片拦截紫外线。7.7.1条件A(400nm拦截条件下)ISO14605规定的A型紫外滤光片。7.7.2条件B(380nm拦截条件下)ISO14605规定的B型UV拦截过滤片。紫外过滤片应直接安装在灯的下方。7.8照度计照度计符合ISO14605的规定。光照强度应使用经校准实验室校准的照度计进行测量，单位为照度（lx），且必须保持与国家标准的可追溯性。使用经过校准实验室校准的照度计，必须保持与国家标准的可追溯性。7.9离心机离心机应能在（4±2）℃,离心力10000g使用。7.10无菌过滤器含聚醚砜（PES）膜或聚偏氟乙烯（PVDF）膜的无菌过滤器（孔径0.2μm～0.45μm）。8试样试样的制备要求如下：a)从材料的平整部分裁剪（50±2）mm×（50±2）mm，厚度宜超过10mm，将其作为标准形状的试样；b)制备9片未经处理的试样和6片经室内光激发的光催化处理的试样。当不能提供未经处理的试样时，可以使用玻璃片代替。需特别注意避免发生微生物污染或者试样之间的交叉污染。当试样尺寸减小时，应减小薄膜尺寸。薄膜的尺寸不得小于800mm2，覆盖膜的边缘应在试样边缘内侧2.5mm至5.0mm之间。9测试程序9.1通则试验方法的流程如图2所示。GB/TXXXXX—XXXX/ISO18071:2016图2贴膜法测试流程9.2菌悬液的制备程序菌悬液的制备程序如下：a)使用铂接种环将储存菌种（见6.1.2）转移到3mL含钙LB培养基中；b)在（37±1）℃培养16h～24h；c)取约1/1000体积的b)中培养物到含钙LB培养基中；注：含钙LB培养基的体积取决于培养皿的数量[见9.6g）]。d)在（37±1）℃培养至细菌浓度至5.0×108cfu/mL～2.0×109cfu/mL。宜重复此步骤多次，以建立浊度与细菌浓度之间的关系。如果已获得充足的数据，此后可以只测试浊度。9.3试验噬菌体溶液的制备试验噬菌体溶液的制备程序如下：a)使用1/500NB稀释噬菌体储备液（见6.1.3），调整滴度为1.0×107pfu/mL～4.0×107pfu/mL；注：含钙的LB的体积取决于培养皿的数量[见9.6g）]。此步骤不宜使用涡旋混合器混匀。b)如果制备的噬菌体溶液不立即使用，可储存于0℃并在2h内使用。9.4室内光照激发的光催化抗病毒活性测试程序室内光照激发的光催化抗病毒火星测试程序如下：a)在培养皿底部放置无菌的保湿滤纸，加入足量的无菌水。在滤纸上放置玻璃棒或玻璃管，以避免试样与滤纸接触，并将试样放置在其上，使室内光激发的光催化处理表面向上。对试验中使用的室内光激发的光催化处理试样和未经处理的试样（前者6片，后者9片）均按此步骤重复放置；注1：为防止保湿玻璃片起雾，往培养皿中加入4mLb)使用无菌移液管吸取0.15mL试噬验菌体溶液并将其滴加到每一个试片上，在液滴上贴覆盖膜然后轻推使噬菌体溶液均匀分散至整个膜表面。小心操作勿使液体溢出膜外。如果试样尺寸不规则试样[见8b）注1]，则按比例调整噬菌体悬液接种体积以适应覆盖膜尺寸（见7.2）；注2：常规接种体积可能会造成噬菌体溶液从膜边缘溢出或者不能均匀分布。这时，可以减半或加倍接种体积。然GB/TXXXXX—XXXX/ISO18071:2016而，如果噬菌体溶液的接种量改变了，每片试样上接种的噬菌体的数量应与标准尺寸试样保持相同，控制在此步骤不宜使用涡旋混合器以免造成噬菌体感染力的丧失。推荐使用手振荡混合。c)将保湿玻璃板放置于培养皿顶部；d)除3片未经处理的试样接种后立即测定噬菌体滴度外（见9.6），其余试样进行光照试验（见9.5）；e)取3片接种噬菌体悬液后的未经处理试样（接种噬菌体溶液后试样使用无菌镊子将其覆盖膜和未经处理的试样放入均质袋内，小心操作勿使噬菌体溶液从覆盖膜或试样上泄漏。加入10mLSCDLP，在袋外用手充分搓洗试样和覆盖膜，以洗出噬菌体溶液。快速对洗出液进行噬菌体滴度测试（见9.6）。如果能证明可以达到相同的结果，则可以使用其他器具替代均质袋。9.5室内光照条件9.5.1根据使用室内光激发的光催化剂材料的实际情况，从7.7所述的两种条件中选择紫外拦截条件。9.5.4与9.5.5试验时间段的试样置于（25±5）℃条件下。9.5.2将照度计放置在照明装置的底部，将覆盖膜和玻璃板放在感应器上方。9.5.3调整灯的强度，使试件表面照度为(1000±50)lx。考虑到有效使用室内光激发的光催化剂材料的实际情况，照度可以在(100±5)lx和(3000±150)lx之间改变。9.5.4将含有细菌悬浮液试样(3个未经处理的试样和3个室内光激发的催化处理试样)的培养皿在光下照射4h。根据室内光激发的光催化剂材料有效使用的实际条件，可以在2h～8h之间选择光照时间。9.5.5将装有已经接种了噬菌体溶液的试样(3片未经处理的试样和3片室内光激发的催化处理的试样)和细菌悬液的培养皿置于黑暗处，时间与9.5.4相同。9.5.6对于9.5.4和9.5.5中的试样，按9.4e)中的方法进行洗脱。9.6噬菌体滴度的测试噬菌体滴度的测试步骤如下：a)熔解瓶内的顶层琼脂，冷却至约50℃后分装2mL至带盖的试管内，于（45±1）℃水浴；b)底层琼脂在（37±1）℃预热；c)使用无菌移液管吸取1mL洗脱液[或储备液，见9.3a）]。加入含有（9±0.1）mL蛋白胨生理盐水的试管中。轻轻拍打使之充分混匀，不应使用涡旋器；此步骤不宜使用涡旋混合器以免造成噬菌体感染力的丧失，推荐使用手振荡混匀。d)使用新的无菌移液管吸取c)中的1mL液体，放入含有（9±0.1）mL蛋白胨生理盐水的试管中，轻轻拍打以充分混匀；e)使用10倍稀释法得到系列稀释液；f)在（37±1）℃条件下预热溶液[洗脱液c)、d)和e)10min；g)吸取0.1mL菌悬液[见9.2d）]至a)中的培养基试管中，轻轻混匀，不应使用涡旋混合器。此步骤不宜使用涡旋混合器以免造成噬菌体感染力的丧失。推荐用手振荡混匀；h)取f)中的1mL液体加到a)中的培养基试管中，轻轻混匀，不得使用涡旋混合器；此步骤不已使用涡旋混合器以免造成噬菌体感染力的丧失，推荐用手振荡混匀。i)将h)中的混合物倾注到预热的底层平板上[b）],每个洗脱液或稀释液都做两个平行试验；j)在室温放置15min～30min；k)待顶层琼脂凝固后，将培养皿置于（37±1）℃培养（18±2）h；GB/TXXXXX—XXXX/ISO18071:2016l)培养结束后，选取出现（30～300）个噬菌斑的培养皿进行计数。10结果计算10.1通则测试结果按下列方法计算。根据ISO80000-1的规定，宜将结果计算值修约至小数点后第二位。10.2试验有效性的要求使用公式（1）计算噬菌体的滴度。N——噬菌体滴度，单位为噬菌斑形成单位数（pfu）；Z——两个平行培养皿上噬菌体的平均数，单位为噬菌斑形成单位数每毫升（pfu/mL）;DF——稀释倍数；当含有1mL洗脱液的培养皿上噬菌斑数小于30时，使用平均数来计算噬菌斑数量。当含有1mL洗脱液的培养皿上噬菌斑数量小于1时，平均数计为1。满足以下4个条件试验有效。如果其中一条或多条不满足，则试验无效，应重新进行测试。a)接种后3片未处理试样上的噬菌体滴度对数平均值满足公式（2）。Logmean——3个试样上噬菌体滴度b)接种后未处理试样上的噬菌体滴度应在1.0×106pfu～4.0×106pfu范围内；c)经过光照后未处理试样的噬菌体滴度均应大于1.0×104pfu。但是，如果使用玻璃板作为未处理试样时，经光照后的噬菌体滴度均应大于1.0×105pfu；d)当放置于暗条件后，未处理试样的噬菌体滴度均应大于1.0×104pfu。但是，如果使用玻璃板作为未处理试样时，噬菌体滴度应大于1.0×105pfu。10.3室内光照激发的光催化剂抗病毒活性值计算试验结束后使用公式（3）和公式（4）来计算室内光激发的光催化剂抗病毒活性值。）；L——室内光照强度，单位为勒克斯（lx）；A——接种后未处理试样的立即洗脱的噬菌体平均滴度，单位为噬菌斑形成单位数（pfu）；BF-L——经室内光照强度F-L照射后未经处理试样的噬菌体平均滴度，单位为噬菌斑形成单位数（pfu）；GB/TXXXXX—XXXX/ISO18071:2016CF-L——经室内光照强度F-L照射后光催化试样的噬菌体平均滴度，单位为噬菌斑形成单位数ΔV=log[BF−L/CF−L−log(BD/A)−log(CD/A)]=log[BF−L/CF−L−log[BD/CD·········(2)ΔV——室内光激活的光催化剂抗病毒活性值；BD——暗条件放置后，未经处理试样的噬菌体平均滴度，单位为噬菌斑形成单位数（pfu）；CD——暗条件放置后，光催化处理试样的噬菌体平均滴度，单位为噬10.4无室内光活性催化剂抗病毒活性值计算在包括不含室内光活性催化剂的情况下，测试结束后使用公式（5）计算不含室内光活性催化抗病毒活性值。VD——暗条件下放置后，不含光催化剂的试样的抗病毒活性值；BD——暗条件放置后，未经处理试样的噬菌体滴度得平均值，单位为噬菌斑形成单位数（pfu）；CD——暗条件放置后，室内光活性催化处理的试样的噬菌体滴度的平均值，单位为噬菌斑形成单位数（pfu）。11试验报告试验报告应包含如下信息：