基因工程的基本操作程序 【知识精讲精研】 高二下学期生物人教版选择性必修三

第二节基因工程的基本操作程序（第2课时）苏云金杆菌中的Bt基因普通棉花细胞含Bt基因的棉花细胞能产生Bt抗虫蛋白的棉花植株转入植物组织培养技术形成获取后能不能直接将它导入受体细胞呢？思考：获取了足够量的Bt基因后，能直接把它导入受体细胞吗？就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解

不能原因那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？02

基因表达载体的构建—-核心一

基因表达载体的构建二使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。基因工程的核心工作（一）目的：DNA复制的起始位点，使其能完成自主复制。位于基因的上游；RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。位于基因的下游；终止mRNA转录鉴别受体细胞中是否含有目的基因，便于将有目的基因的细胞筛选出来。构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？（二）组成：基因表达载体=启动子+目的基因+终止子+标记基因+复制原点限制酶切割位点启动子的类型：①组成型启动子：每种组织器官中均发挥作用。②组织特异型启动子：特定组织器官中才能发挥作用。③诱导型启动子：特定条件下刺激才能发挥作用。诱导型启动子诱导物作用激活或抑制目的基因表达诱导型启动子：注意：①生物之间进行基因交流，使用受体生物自身基因的启动子比较有利于基因的表达；②通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；拓展延伸

载体

≠

基因表达载体二者都有：标记基因和复制原点两部分DNA片段。基因表达载体：在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子。思考：“载体”＝“基因表达载体”？思考:“启动子”＝“起始密码子”？

“终止子”＝“终止密码子”？启动子（DNA分子中）≠起始密码子（mRNA分子中）

终止子（DNA分子中）≠终止密码子（mRNA分子中）

终止子非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子三、基因表达载体的构建过程：载体（质粒）DNA分子（含目的基因）限制酶处理带有黏性末端或平末端的切口带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种思考：该过程需要用到基因工程哪些工具酶？重组DNA分子目的基因分析基因表达载体构建的方法任务一（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？不能因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。请结合下图，回答问题：质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。分析基因表达载体构建的方法任务一（2）用同一种限制酶分别切割质粒和外源DNA构建重组DNA的方法，称为“单酶切法”。如使用限制酶EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，其结果如下：①黏性末端1与2能被DNA连接酶连接吗？黏性末端3与4呢？②黏性末端1与3、2与4能被DNA连接酶连接吗？1与4、2与3呢？思考:使用同一种DNA限制酶进行切割，会得到几种重组DNA？有何缺点？怎么改进？载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接反向连接11’22’122’1’22’1’1双酶切：用两种不同的限制酶分别对目的基因和质粒切割，得到两种不同的末端，可减少自身环化及反向连接等问题出现。思考：如何防止自身环化和反向连接的问题？例如:使用限制酶BamHⅠ和HindⅢ分别同时切割质粒和外源DNA，结果如下：①黏性末端1与2能被DNA连接酶连接吗？黏性末端3与4呢？②黏性末端1与3、2与4能被DNA连接酶连接吗？1与4、2与3呢？某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是

()A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli

DNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用

T4DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接√课堂练习限制酶的选择(1)不破坏目的基因原则；(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，提高筛选成功率。(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。（2021•辽宁节选）为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因),利用大肠杆菌表达该蛋白。图1为所用载体图谱示意图。为使phb2基因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入

和

两种不同限制酶的识别序列。课堂练习PvｕⅡ、EcoRⅠ03将目的基因导入受体细胞—-关键

（一）方法农杆菌转化法（主要）花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法（又叫感受态细胞法）——我国科学家独创将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞基因枪法（了解）受精卵或体细胞主要是：受精卵主要是：原核细胞三、将目的基因导入受体细胞（1）花粉管通道法（我国科学家独创）方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中目的基因目的基因适用生物：开花植物1.将目的基因导入植物细胞受体细胞：受精卵（或合子或早期胚胎细胞）花粉落到柱头上刺激花粉管萌发并生长至子房滴管蘸取外源DNA溶液涂抹雌蕊柱头外源DNA沿花粉管通道进入胚囊外源DNA进入受精卵DNA随机整合利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。操作简单、技术成本低，免去了组织培养及诱导再生植株的全套人工培养过程。原理：优点：农杆菌:是生活在土壤中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，并诱导产生冠瘿瘤,而对大多数单子叶植物没有侵染能力。原理：农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞、并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。（2）农杆菌转化法基因表达载体受体细胞导入动物植物微生物目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。转化:此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同。构建表达载体导入植物细胞目的基因插入植物细胞染色体DNA上表达新性状转入农杆菌过程：载体：农杆菌Ti质粒目的基因①两次拼接第一次拼接：目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。②两次导入第一次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)：含目的基因的T-DNA导入受体细胞。

导入的受体细胞是什么细胞呢？受精卵或体细胞双子叶、裸子植物受损伤口分泌酚类物质和糖类物质吸引农杆菌向受伤组织集中将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞染色体DNA上。激活Vir区基因，导致T-DNA加工和转移（3）基因枪法（了解）将直径4um的钨粉或金粉在供体DNA中浸泡，然后用基因枪将这些粒子打入细胞、组织或器官中，具有一次处理多个细胞的优点，但转化效率较低。2.将目的基因导入动物细胞（1）常用方法：（2）受体细胞:显微注射法受精卵①体积大，易操作。②易表现出全能性。（3)过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物问题:为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？（1）常用方法：Ca2+处理原核细胞（常选择大肠杆菌）（2）受体细胞：优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。Ca2+感受态细胞吸收Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。3.将目的基因导入微生物细胞实例：利用转基因大肠杆菌生产药物为何导入的不是胰岛素基因而是cDNA?大肠杆菌生产出的胰岛素具有生物活性？原核生物细胞里没有相应的酶来去除内含子；原核生物没有真核的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等）受体细胞植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法受体细胞转化过程以农杆菌转化法为例：将目的基因插入Ti质粒的T­DNA上↓转入农杆菌中↓导入植物细胞↓整合到受体细胞的DNA上提纯含目的基因的表达载体↓显微注射↓受精卵发育↓具有新性状的个体Ca2＋处理细胞↓感受态细胞↓基因表达载体与感受态细胞混合↓感受态细胞吸收DNA分子（二）将目的基因导入受体细胞——方法比较花粉管通道法、农杆菌转化法、基因枪法受精卵或体细胞显微注射技术受精卵Ca2＋处理法法原核细胞核心归纳受体细胞的选择(1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。(2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。(3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌有优势。按前面三个步骤进行了操作，是否可以确定Bt基因进入了受体细胞并能维持稳定？是否表达出Bt蛋白？表达出的Bt蛋白是否具有杀虫的功效？如何判断？04

目的基因的检测与鉴定—-保证目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。类型检测内容方法分子水平的检测个体生物学水平的鉴定DNA水平：受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因RNA水平：目的基因是否转录出了mRNAPCR或DNA分子杂交技术蛋白质水平：目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体是否具有相应性状抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等PCR或分子杂交技术等四、目的基因的检测与鉴定1.检测目的：2.检测内容及方法

检测内容：目的基因是否插入到受体细胞的染色体DNA上（存在）如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因检测方法：方法①：PCR等技术提取DNAPCR操作是否扩增出目的基因M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；电泳操作害虫死亡抗虫棉PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果（1）分子水平检测

方法②：DNA分子杂交技术(DNA单链——DNA单链)检测工具：基因探针带有标记（放射性同位素标记、荧光分子标记等）的目的基因片段——单链检测原理：将转基因生物的基因组DNA提取出来，用标记了的目的基因作为基因探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，就表明目

的基因已插入染色体DNA中。如：检测Bt基因是否转录出mRNABtM3C0T-9T-2T-51T-5T-23T-11T-20T-21T-34T-1010个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录提取mRNAPCR操作是否扩增出目的基因对扩增产物进行检测害虫死亡抗虫棉逆转录产生DNA检测内容：目的基因是否转录检测方法：方法①：PCR等技术检测方法：方法②：分子杂交技术（DNA—RNA）——分子杂交检测原理：用标记的目的基因作为基因探针，与转基因生物中提取

mRNA杂交，若出现杂交带，表明目的基因转录出mRNA。苏云金芽孢杆菌提取Bt毒蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交检测内容：目的基因是否翻译检测方法：抗原—抗体杂交