第二章 生物制药工艺技术基础课件

第二章生物制药工艺技术基础

Basisofbiopharmaceuticaltechnology基因工程制药技术基础细胞工程制药技术基础酶工程制药技术基础发酵工程制药技术基础第二章生物制药工艺技术基础基因工程制药技术基础back第二章生物制药工艺技术基础

基因工程(geneticengineering)：外源DNA，通过具有复制能力的载体分子形成重组DNA分子，导入受体细胞，进行持久稳定的复制和表达，使受体细胞产生外源DNA或蛋白质。

基因工程操作过程：（1）获得目的基因；（2）构建DNA重组体；（3）将重组体导入宿主细胞；（4）工程菌的克隆与鉴定；（5）目的基因扩增与蛋白表达。

P72第二章生物制药工艺技术基础基因工程技术的应用特点：为癌症、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病的预防、治疗和诊断提供新型疫苗、药物和诊断试剂。基因工程技术的最大好处在于它能从极端复杂的机体细胞内取出所需要的基因，将其在体外进行剪切拼接、重新组合，然后转入适当的细胞进行表达，从而生产出比原来多数百、数千倍的相应的蛋白质。第二章生物制药工艺技术基础

基因工程技术生产药品的优点：可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质，为临床使用提供有效的保障；可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造；利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。

第二章生物制药工艺技术基础获得目的基因构建DNA重组体将重组体导入宿主细胞鉴定筛选阳性

克隆基因工程药物制造过程上游阶段P72第二章生物制药工艺技术基础培养工程菌分离纯化表

达产物除菌过滤半成品检定制剂成品检定包装基因工程药物制造过程下游阶段P72第二章生物制药工艺技术基础一目的基因的制备（一）构建cDNA文库，筛选目的cDNA（二）PCR技术（三）化学合成法：较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。目的基因的获取途径：P74第二章生物制药工艺技术基础

克隆蛋白质药物基因的一个主要目的是为了高效的表达该基因，从而大量地生产原本难以获得的药物。

基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键。三基因表达系统第二章生物制药工艺技术基础宿主细胞的基本要求：

①容易获得较高浓度的细胞；②能利用易得廉价原料；③不致病、不产生内毒素；④发热量低，需氧低；⑤容易进行代谢调控；⑥容易进行DNA技术操作；⑦产物的产量高，且易提取纯化。（一）宿主细胞的选择第二章生物制药工艺技术基础原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；真核细胞：酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞。宿主细胞的分类：P83第二章生物制药工艺技术基础（1）大肠杆菌Escherichiacoli优点：遗传背景清楚、技术操作简单，所需的成本相对较低和高表达量。缺点：目的蛋白常以包涵体(inclusionbody)形式表达，纯化提取困难。1、原核细胞P83第二章生物制药工艺技术基础（2）芽孢杆菌Bacillus：分泌能力强，不形成包含体。有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解。（3）链霉菌Streptomyces：可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力。第二章生物制药工艺技术基础（1）酵母：表达产物能可进行折叠和翻译后修饰与糖基化，表达量高，产物易纯化。（2）丝状真菌：很强的分泌能力；有成熟的发酵和后处理工艺。

2、真核细胞P86第二章生物制药工艺技术基础（3）哺乳动物细胞：中国仓鼠卵巢细胞（CHO）和猴肾细胞（COS）。特点：产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。但动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。P87第二章生物制药工艺技术基础工程菌的培养过程：摇瓶操作（温度、pH、培养基组分、碳氮比）；培养罐操作（确定培养参数、控制方案、顺序）（一）、基因工程菌的培养方式：1、分批培养（batchculture）2、补料分批培养（fed-batchculture）3、连续培养（continuousculture）4、透析培养（dialysisculture）

四基因工程菌的发酵P88-90第二章生物制药工艺技术基础（二）基因工程菌的发酵工艺

基因工程菌的发酵工艺

传统微生物发酵工艺材料带外源基因重组载体的微生物不含外源基因的微生物目的使外源基因高效表达，尽量减少宿主本身蛋白的污染

自身基因表达所产生的初级或次级代谢产物1、培养基的影响

2、接种量的影响3、温度的影响4、溶解氧的影响5、诱导时机的影响6、pH的影响第二章生物制药工艺技术基础

基因工程药物分离纯化的一般流程发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离包含体细胞碎片分离变性复性浓缩初步分离制剂产品高度纯化五基因工程药物的分离纯化第二章生物制药工艺技术基础

六基因工程药物的质量控制（一）原材料的质量控制确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。（二）培养过程的质量控制在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。第二章生物制药工艺技术基础（三）纯化工艺中的质量控制

1、产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA都控制在规定限度以下。

2、在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。（四）目标产品的质量控制

1、产品的鉴定

2、纯度分析

3、生物化学测定

4、稳定性考察

5、产品一致性的保证

第二章生物制药工艺技术基础

基因工程药物应用实例第二章生物制药工艺技术基础治疗糖尿病的胰岛素，是一种51个氨基酸残基组成的蛋白质。1982年美国EliLilly公司推出基因工程制造的人胰岛素，商品名为(Humulin)。干扰素用于治疗肝炎等病毒感染性疾病，有良好疗效。1升发酵液中所得的干扰素相当于过去从1000升人血中所得。生产成本也大为降低。目前用基因工程生产的蛋白质药物已达数十种，许多以前原本不可能大量生产的生长因子，凝血因子等蛋白质药物，现在用基因工程办法可大量生产。1.基因工程用于生产蛋白质类药物第二章生物制药工艺技术基础2.基因工程用于疫苗生产常用的制备疫苗的方法，一种是减毒活疫苗，一种是灭活疫苗。两种疫苗各有自身的弱点。减毒活疫苗隐含着感染的危险性。灭活疫苗免疫活性不高，需加大注射量或多次接种。利用基因工程制备重组DNA疫苗，可以克服上述缺点，重组DNA疫苗就是利用基因工程的方法将编码蛋白质的基因重组到载体上，再导入细胞中大量生产，表达免疫原性较强、无感染毒性的多肽制成的疫苗。乙型肝炎基因工程疫苗就是由编码HBsAg的基因插入到酿酒酵母基因组中表达的产物。第二章生物制药工艺技术基础3.基因工程用于基因治疗基因治疗：将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。复合免疫缺陷综合征黑色素瘤血友病第二章生物制药工艺技术基础

细胞工程制药技术基础back第二章生物制药工艺技术基础动物细胞工程制药技术基础第二章生物制药工艺技术基础（一）动物细胞的获得1、原代细胞：直接取自动物组织器官2、二倍体细胞：原代细胞经过转化、筛选、克隆3、转化细胞系：失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。（二）P92-93第二章生物制药工艺技术基础（三）动物细胞大规模培养技术1、悬浮培养（suspensionculture）让细胞自由的悬浮于培养液中培养（操作简便、但细胞小不适合灌流培养）2、贴壁培养（anchorageculture）让细胞附在某种基质上生长繁殖（应用广、可灌流培养、但需大面积，传质差）3、微载体培养（microcarrierculture）微载体培养是细胞附着和生长在微载体表面。P94-95第二章生物制药工艺技术基础细胞A细胞B杂种细胞灭活的病毒物理法化学法仙台病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒离心振动电激聚乙二醇细胞融合(cellfusion)是指在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。第二章生物制药工艺技术基础用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核病毒颗粒细胞核第二章生物制药工艺技术基础蛙血细胞有多核现象，为什么？精子和卵子结合是细胞融合吗？是否只有近缘或同种生物能够进行细胞融合？1958年岗田善雄用高浓度的水仙病毒和小鼠艾氏腹水瘤细胞得以融合，这一发现，打破了细胞融合只能在同种生物间进行的枷锁。第二章生物制药工艺技术基础杂交瘤细胞和单克隆抗体1975年从事免疫学研究的Kohlor和Milstein利用仙台病毒诱导经过免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，并最终获得了能分泌单一抗体的杂种细胞，该杂种细胞具有大量繁殖的能力，以及能长期分泌单克隆抗体。使免疫学领域出现了一场革命性的转机。为此两人获得1984年的诺贝尔医学奖。P97第二章生物制药工艺技术基础

单克隆抗体制备过程

注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交细胞细胞培养筛选，继续培养足够数量的、能产生特定抗体的细胞群体外培养注射到小鼠腹腔单克隆抗体P97第二章生物制药工艺技术基础植物细胞工程制药技术基础第二章生物制药工艺技术基础植物细胞工程通常采用的技术手段

植物组织培养

植物体细胞杂交所采用技术的理论基础

植物细胞的全能性细胞全能性（totipotency）：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性。第二章生物制药工艺技术基础一、植物组织培养概念科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。第二章生物制药工艺技术基础离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织根芽植物体脱分化再分化脱分化由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化。再分化脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重新分化成根或芽等器官，这一过程称为植物细胞的再分化。一、植物组织培养植物组织培养过程第二章生物制药工艺技术基础4.植物组织培养的应用：

（1）试管苗的快速繁殖（2）无病毒植物的培育（3）提取原料（4）人工种子（5）转基因植物的培育含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的pH、适时光照等。一、植物组织培养3.植物组织培养条件：第二章生物制药工艺技术基础离体植物细胞愈伤组织胚状体根芽植物体脱分化再分化一、植物组织培养

植物组织培养应用举例（一）胚状体（somaticembryo）：指由培养细胞诱导分化出的胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。第二章生物制药工艺技术基础

紫草紫草素

愈伤组织一、植物组织培养

植物组织培养应用举例（二）第二章生物制药工艺技术基础胚状体人工种皮人工胚乳一、植物组织培养

植物组织培养应用举例（三）人工种子(artificalseeds)定义：指通过组织培养技术，把植物组织的细胞培养成在形态及生理上与天然种子胚相似的胚状体，然后将它包埋于有一定营养成分和保护功能的介质中，在适宜的条件下发芽出苗。第二章生物制药工艺技术基础1、定义：也称原生质体融合（Protoplastfusion），是指将植物不同种、属，甚至科的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。2、优势：（与有性杂交方法比较）

打破了不同种生物间的生殖隔离限制，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围。二、植物体细胞杂交

（Somatichybridization）

第二章生物制药工艺技术基础植物A细胞植物B细胞去壁原生质体A原生质体B原生质体融合融合体再生壁杂种细胞细胞分裂愈伤组织杂种植株去壁的常用方法：酶解法（纤维素酶、果胶酶等）

原生质体融合方法：物理法：离心、振动、电刺激等化学法：聚乙二醇（PEG）二、植物体细胞杂交过程：第二章生物制药工艺技术基础(1)(1)(2)(3)(4)(5)二、植物体细胞杂交过程示意图第二章生物制药工艺技术基础白菜甘蓝白菜－甘蓝二、植物体细胞杂交植物体细胞杂交应用第二章生物制药工艺技术基础细胞工程的好处以植物细胞全能性为基础的植物组织和细胞培养已经获得各种试管植物上千种，并可以获得有重要经济价值的药物和其他产品。细胞器移植、体外受精、胚胎培养，为植物和家畜的品种改良提供了新的途径。细胞融合技术，可以获得前所未有的生物为人类造福。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，被称为“生物导弹”，在治疗癌症方面发挥着巨大作用。第二章生物制药工艺技术基础酶工程制药技术基础back第二章生物制药工艺技术基础

酶的特性定义：酶是由活细胞产生的具有特殊催化功能的一类蛋白质。

催化效率高专一性强反应条件温和催化活性受到调节和控制第二章生物制药工艺技术基础（一）、酶工程(enzymeengineering)酶工程是酶学和工程学相互渗透结合发展而形成一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能或者药用功效，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。主要包括药用酶的生产和酶法制药两方面的技术。P102第二章生物制药工艺技术基础

药用酶的生产药用酶是指可用于预防和治疗疾病的酶。例如：蛋白酶治疗消化不良；L-天冬酰胺酶治疗白血病；超氧化物歧化酶防护辐射损伤；溶菌酶抗菌消炎；尿激酶治疗心肌梗塞等等。药用酶的生产主要包括发酵生产，药用酶的分离纯化，药用酶的分子修饰等。第二章生物制药工艺技术基础酶法制药酶法制药是指利用酶的催化作用而制造出具有药用功效的物质的技术过程。例如：青霉素酰化酶生产半合成抗生素；β-酪氨酸酶生产多巴；核苷磷酸化酶催化阿糖尿苷生成阿糖腺苷等等。酶法制药主要包括酶的催化反应，酶的固定化，酶的非水相催化等。第二章生物制药工艺技术基础(二)、固定化酶(immobilizedenzyme)

定义：是指借助于物理和化学的方法把酶束缚在一定空间内并具有催化活性的酶制剂。广义的固定化酶包括固定化酶和固定化细胞。

优点：（1）固定化稳定性提高（2）可重复使用、提高使用效率、降低成本（3）提高强度，便于连续、自动、规模化生产（4）便于产物的分离、纯化缺点：固定化过程中往往会引起酶的失活P102第二章生物制药工艺技术基础（三）、酶的固定化方法

(1)吸附法：可分为物理吸附法和离子吸附法。离子吸附法是将酶与含有离子交换剂的水溶性载体相结合。(2)包埋法：凝胶包埋法和微囊化包埋法。是将酶或细胞定位在高聚物网格或不同构型膜外壳内。EEEEEEEEP103第二章生物制药工艺技术基础(4)交联法：使用双功能或多功能试剂与酶分子之间进行分子间的交联反应的固定化方法。EEEEEEEEEEE(3)共价结合法：通过化学偶联使酶的活性基团与载体表面活泼基团共价结合。P105第二章生物制药工艺技术基础1.固定化细胞：将细胞限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。

三、固定化细胞的制备2.固定化细胞的特点有细胞特性，生物催化剂功能，固相催化剂特点。优点：①无须进行酶的分离纯化②保持酶的原始状态，酶回收率高③比固定化酶稳定性高④细胞内酶附助因子可再生⑤细胞本身含多酶体系⑥抗污染能力强P106第二章生物制药工艺技术基础3.固定化细胞的制备技术

(1)载体结合法是将细胞悬液直接与水不溶性的载体相结合的固定化方法。

(2)包埋法

将细胞定位于凝胶网格内的技术。

(3)交联法

用多功能试剂对细胞进行交联的固定化方法。

(4)无载体法靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。P106第二章生物制药工艺技术基础第五节酶工程在医药工业中的应用固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸（6-APA）培养固定转化过滤抽提E.Coli

细胞

青霉素

转化液

滤液

6-APA粗品

第二章生物制药工艺技术基础发酵工程制药技术基础back第二章生物制药工艺技术基础微生物发酵技术1857年法国化学家、微生物家巴斯德提出了著名的发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。”巴斯德认为：酿酒是发酵，是微生物在起作用；酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟。同时，把发酵的微生物分离出来，通过人工培养，根据不同的要求去诱发各种类型的发酵，获得所需的发酵产品。

第二章生物制药工艺技术基础发酵工程FermentationEngineering：采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程中的一种新技术。

第二章生物制药工艺技术基础发酵工程的内容包括以下的基本步骤：菌种的选育培养基的配置灭菌扩大培养和接种发酵过程分离提纯第二章生物制药工艺技术基础发酵工程Continuouscentrifuges第二章生物制药工艺技术基础（1）自然选育依据自发突变原理，通过不断分离筛选，去衰变菌落，选择高产菌，达到纯化、复壮、稳定生产目的。方法：a平板划线法b稀释平板法1．菌种的选育P52第二章生物制药工艺技术基础

（2）诱变育种

①出发菌株的选择

a稳定性b具备某种优良性状的菌株

c对诱变剂敏感d生理状态及生长时间②诱变处理

a化学诱变b物理诱变c生物诱变

③筛选

a随机筛选b半理性化筛选

（3）现代菌种选育技术①杂交育种②原生质体融合③基因工程技术P52-55第二章生物制药工艺技术基础2培养基的配置培养基配置的原则：根据不同的菌种，选择不同的材料配制培养基

配制的培养基应满足微生物在碳源、氮源、生长因子、水、无机盐等方面的营养要求，并为微生物提供适宜的pH。培养基的营养要协调，以利于产物的合成。培养基在满足微生物的营养需求的基础上应尽量降低生产成本，以得到更高的经济效益。举例：发酵生产常采用天然成分的液体培养基。而且，经常用野生的植物淀粉、甘蔗渣、秸秆，以及乙醇、醋酸等石化产品代替粮食来配制培养基。

P58-61第二章生物制药工艺技术基础3灭菌灭菌与除菌方法加热灭菌、辐射灭菌、介质过滤灭菌、化学灭菌灭菌的原因：在发酵过程中如混入其他微生物，将与菌种形成竞争关系，对发酵过程造成不良影响。举例：如果在谷氨酸发酵过程中混入放线菌，则放线菌分泌的抗生素就会使大量的谷氨酸棒状杆菌死亡。如果在青霉素生产过程中污染了杂菌，这些杂菌则会分泌青霉素酶，将合成的青霉素分解掉。P61-63第二章生物制药工艺技术基础（1）染菌对产物提取和产品质量的影响对过滤的影响：发酵液的粘度加大由于发酵不彻底，基质的残留浓度增加造成的后果：过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡大幅度降低过滤收率3灭菌第二章生物制药工艺技术基础对提取的影响有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质，易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开离子交换工艺：杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量3灭菌（1）染菌对产物提取和产品质量的影响第二章生物制药工艺技术基础对产品质量的影响对内在质量的影响：染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。对产品的纯度有较大影响。对产品外观的影响：一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现混浊，影响产品的外观。3灭菌（1）染菌对产物提取和产品质量的影响第二章生物制药工艺技术基础（2）发酵过程中染菌的检查判断杂菌的检查方法

①显微镜检查：染色镜检②平板划线检查：倒平板空培养待测样品划线培养观察③酚红肉汤培养检查：无菌肉汤培养基空培养接入样品培养观察3灭菌第二章生物制药工艺技术基础各种检查方法的比较显微镜检查方法简便、快速，能及时发现杂菌，但由于镜检取样少，视野的观察面也小，因此不易检出早期杂菌。平板划线法和肉汤培养方法的缺点是需经较长时间培养(一般要过夜)才能判断结果，且操作较繁琐，但它要比显微镜能检出更少的杂菌，而且结果也更为准确。3灭菌（2）发酵过程中染菌的检查判断第二章生物制药工艺技术基础（3）发酵染菌的防止种子带菌的原因及防止带菌的原因无菌室的无菌条件不符合要求培养基灭菌不彻底操作不当种子带菌的防止

种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂菌。种子培养的设备和装置有无菌室、灭菌锅和摇瓶机等。3灭菌第二章生物制药工艺技术基础（4）染菌后的挽救措施

发酵早期染菌可以适当添加营养物质，重新灭菌后再接种发酵。中后期染菌，如果杂菌的生长将影响发酵的正常进行或影响产物的提取时，应该提早放罐。有些发酵染菌后发酵液中的碳、氮源还较多，如果提早放罐，这些物质会影响后处理提取使产品取不出，此时应先设法使碳、氮源消耗，再放罐提取。3灭菌第二章生物制药工艺技术基础有时发酵罐偶尔染菌，原因一时又找不出，一般可以采取以下措施：连续灭菌系统前的料液贮罐在每年4一10月份(杂菌较旺盛生长的时间)加入0.2%甲醛，加热至80°C，存放处理4小时，以减少带入培养液中的杂菌数。对染菌的罐，在培养液灭菌前先加甲醛进行空消处理。甲醛用量每立方米罐的体积0.12~0.17升。对染菌的种子罐可在罐内放水后进行灭菌，灭菌后水量占罐体的三分之二以上。这是因为细菌芽孢较耐干热而不耐湿热的缘故。

3灭菌（4）染菌后的挽救措施

第二章生物制药工艺技术基础（1）微生物生长动力学

微生物的发酵方式可分为分批培养（batchculture）、补料分批培养（fed-batchculture）、连续培养（continuousculture）、透析培养（dialysisculture）

分批发酵：在灭菌的培养基中接种相应的微生物，然后不再加入新的培养基。

补料分批发酵：发酵过程中在不同时期加入越来越多的营养物，但不除去旧的营养物。

连续发酵：在发酵过程中不断加入新鲜的培养基，同时放出等体积的旧的含悬浮的微生物的培养物。

透析培养：利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。4扩大培养和接种

P69-70第二章生物制药工艺技术基础减速期加速期对数期延迟期停滞期死亡期时间图6-2在罐批发酵过程中细胞数量与时间的关系示意图Lg（细胞数）第二章生物制药工艺技术基础1、延迟期：细胞接种到灭菌的培养基后，细胞的数目并不是立即增长，这一时期称为延迟期。细胞进入延迟期可能是由于某种底物的缺乏或产物的抑制，而细胞需要重新启动它们的代谢系统，以适应新环境。2、加速期：延迟期后，对数期前，细胞生长速度逐渐加快的时期称为加速期。3、对数期：在细胞生长的对数期，细胞总量几次翻番，但是细胞的特定生长率保持不变。4、减速期：由于在对数期末期培养基中所含的细胞数目很大，底物可能被迅速吸收利用。所以减速期很短。5、停滞期：减速期后，由于某种关键底物被耗尽，或是一种或几种抑制生长的代谢产物的积累，培养体系中细胞数量的增长逐渐停止。6、死亡期：细胞的能量耗尽，代谢停止。P69第二章生物制药工艺技术基础（2）补料分批发酵优点：在发酵的不同时期不断加入培养基，使培养基的量逐渐增大，这可以延长对数期与停滞期的持续时间，增加生物量的积累，也能增加停滞期的细胞代谢物的积累。缺点：停滞期的微生物常常会产生蛋白水解酶或蛋白酶，这些酶有可能降解重组微生物所产生的任何一种蛋白产物。解决方法：在用重组微生物生产蛋白时，必须阻止发酵进行到停滞期。直接检测发酵时的培养基浓度的变化比较困难，所以，人们一般采用与之相关的其它因素，如有机酸的产生、pH值的变化、CO2的产生等作为检测的标准，来推断应在何时加入新的培养基。4扩大培养和接种

第二章生物制药工艺技术基础（3）连续发酵

在连续发酵时，如果生物反应其中的细胞总数与总体积均保持不变，那么体系就达到了稳态，即是说，取出的细胞与新生细胞的数目恰好处在平衡状态。优点：可以降低成本；易于实现生产过程的仪表化和自动化；有利于对微生物生理、生态及反应机制的研究等。缺点：在培养过程中某些细胞可能会丢失重组质粒，从而成为反应器中的优势菌群，降低产量，将外源基因整合到宿主染色体上可避免这一问题；长时间维持工业规模生产的无菌状态很困难；工业发酵用的培养基质量不如实验室用的培养基那样有保证，不同批次的培养基质量可能不同。4扩大培养和接种

第二章生物制药工艺技术基础发酵产物：发酵产物主要在菌体生长的停滞期产生。发酵进程在发酵过程中随时取样检测培养液中细菌数目、产物浓度以了解发酵进程，及时添加必需的培养基成分来延长菌体生长停滞期的时间，以得到更多的发酵产物。发酵条件发酵生产中温度、pH、溶氧量等对发酵过程有重大影响。5发酵过程第二章生物制药工艺技术基础

发酵过程的优化氧气浓度：以无菌空气的形式持续向培养基中通气，达到细菌生长所需的氧气浓度。培养基：培养基的碳氮比(C/N)值是衡量一种培养基是否适用的重要指标之一。充分混合：细胞的养分供应充足，防止有毒代谢产物局部积累。温度：微生物在低于最适温度时生长缓慢，细胞的生产力降低；而如果温度过高则会导致细胞热休克，使细胞产生大量的胞内蛋白酶，而降低目的蛋白的产量。pH值：绝大多数微生物在pH5.5-8.5时生长得最好。在发酵过程中必须对培养基的pH值监测，并根据监测结果适量加入酸和碱以维持恒定的pH值。5发酵过程P71-72第二章生物制药工艺技术基础（1）、杂蛋白质的去除加入凝聚剂

凝聚作用(coagulation):在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。加入絮凝剂凝絮作用(flocculation):当往胶体悬浮液中加入絮凝剂时，胶体可强烈地吸附在凝絮剂表面的功能团上，而且一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同颗粒表面上，产生架桥连接，形成粗大的凝絮团沉淀出来，有助于过滤。6分离提纯

细胞培养液的预处理P117-119第二章生物制药工艺技术基础絮凝剂的分子量

絮凝剂的用量

溶液pH值

搅拌速度和时间

影响絮凝效果的因素P118第二章生物制药工艺技术基础变性沉淀等电点沉淀加各种沉淀剂沉淀吸附:四环素发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，生成亚铁氰化锌钾K2Zn3[Fe(CN)6]2的胶状沉淀，能将杂蛋白质和菌体等黏附在其中而除去。（1）、杂蛋白质的去除细胞培养液的预处理6分离提纯

P117-119第二章生物制药工艺技术基础（2）多糖的去除可用酶将多糖转化为单糖提高过滤速度。黏多糖可与一些阳离子表面活性剂如十六烷基溴化铵（CTAB）生成沉淀去除。（3）高价金属离子的去除离子交换法沉淀法

Ca2+草酸

Mg2+

磷酸盐,三聚磷酸钠

Fe3+

黄血盐细胞培养液的预处理6分离提纯

P118第二章生物制药工艺技术基础细胞破碎

机械法物理法化学法1、匀浆法1、干燥1、化学试剂处理2、珠磨法2、冻融2、制成丙酮粉3、超声波3、渗透压冲击3、酶解法6分离提纯

P120第二章生物制药工艺技术基础

机械法方法原理特点匀浆法基于液相的剪切力适用面广，处理量大，速度快，在工业生产上广泛应用，但不适用于某些高度分枝的微生物，另外产热大，可能造成生物活性物质失活珠磨法利用研磨作用破碎适用面广，处理量大，在工业生产上广泛应用；产热大，可能造成生物活性物质失活超声波利用超声波的空穴作用使细胞破碎产热量大，且散热不易，成本高，仅适用于小量样品破碎选择破碎方法的依据第二章生物制药工艺技术基础物理法方法原理特点干燥法干燥后的菌体细胞膜渗