(高清版)GBT 40251-2021 牡蛎单孢子虫病诊断规程 原位杂交法

ICS65.020.30牡蛎单孢子虫病诊断规程国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40251—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。本文件起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站。1牡蛎单孢子虫病诊断规程原位杂交法本文件规定了牡蛎单孢子虫病诊断规程中病原定位方法的要求，针对主要病原尼氏单孢子虫2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文SC/T7205.1—2007牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分：组织印片的细胞学诊断法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语AP:碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)DAFA:戴维森氏乙醇-福尔马林-乙酸固定液(davidson'salcohol-formalin-aceticacidfixative)DIG:地高辛(digoxigenin)EDTA-Na₂·2H₂O:二水合乙二胺四乙酸二钠(Ethylenediaminetetraaceticacid,disodiumdi-hydrate)MgCl₂·6H₂O:六水合氯化镁(magnesiumchloridehexahydrate)Na₂HPO₄·12H₂O:十二水合磷酸氢二钠(sodiumphosphatedibasicdodecahydrate)Na₃C₆H₅O₇·2H₂O:二水合柠檬酸三钠(sodiumcitratedihydrate)NBT:氯化硝基四氮唑蓝(4-Nitrobluetetrazoliumchloride)KH₂PO₄:磷酸二氢钾(potassiumphosphatemonobasic)KCl:氯化钾(potassiumchloride)PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersalinebuffer)SSC:枸橼酸钠缓冲液(salinesodiumcitratebuffer)Tris:三羟甲基氨基甲烷(Tris[hydroxymethyl]aminomethane)25.3Na₃C₆H₅O₇·2H₂O。5.5Na₂HPO₄·12H₂O。5.6KH₂PO₄。5.10EDTA-Na₂·2H₂O。5.13蛋白酶K。5.14多聚赖氨酸(相对分子质量25000)。5.15聚乙烯醇(相对分子质量30000～70000)。5.17俾斯麦棕Y。5.19聚蔗糖400。5.20聚乙烯吡咯烷酮360。5.24石蜡(熔点52℃~54℃):切片级。5.26丹哈特液(Denhardt's)。5.27鲑精DNA。5.32碱性磷酸酶偶联的DIG抗体(AP-抗DIG,0.75U/μL,4℃):生化试剂。5.3695%乙醇。5.37甲醛(37%)。3GB/T40251—20215.4180%乙醇：按A.2配制。5.4270%乙醇：按A.3配制。5.4350%乙醇：按A.4配制。5.452×SSC:按A.7配制。5.470.5×SSC:按A.9配制。5.48PBS:按A.10配制。5.49100pg/mL蛋白酶K:按A.12配制。5.500.4%甲醛：按A.13配制。5.52缓冲液I:按A.16配制。5.53缓冲液Ⅱ:按A.17配制。5.54缓冲液Ⅲ:按A.19配制。5.55缓冲液IV:按A.21配制。5.570.5%俾斯麦棕Y(BismarkbrownY):按A.24配制。6.4普通冰箱。6.5切片保湿孵育箱。6.6展片水浴锅。6.7烘片机。7样品采样数量、方法和保存运输应符合SC/T7205.1—2007附录B的要求。海水温度高于10℃,且盐度高于15%时为采样的最佳时期。7.3样品的采集套膜。48试验步骤组织块依次浸入盛有不同浓度乙醇溶液的烧杯中；流程如下：70%乙醇(1h45min)→80%乙醇脱水后的组织块依次浸入盛有无水乙醇：二甲苯(1:1)混合液和二甲苯溶液的烧杯中，流程如下：无水乙醇：二甲苯(1:1)(25min)→二甲苯(20min)→二甲苯(20min)。用蜡铲或刀片将包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，保留组织周围(每次3min)。8.2.2切片平放在切片保湿孵育箱中，吸取500μL100pg/mL蛋白酶K溶液，加到每张组织切片上，8.2.3把组织切片上的蛋白酶K溶液吸净，然后将其浸入预冷到4℃的0.4%甲醛溶液中5min。8.2.5把组织切片平放在切片保湿孵育箱中，添加500μL杂交缓冲液至每张组织切片，42℃孵育8.2.6添加500μL含2ng/μLDIG标记的寡聚核苷酸探针杂交混合液至每张组织切片，置于90℃~95℃平板烘片机上保温10min。8.2.7将组织切片置于平整的冰面上淬冷1min。5GB/T40251—20218.2.8在切片保湿孵育箱内42℃下孵育16h～18h。8.2.9依次用缓冲液2×SSC(5min,室温)、2×SSC(5min,室温)、1×SSC(5min,室温)、1×SSC缓冲液I(1min～2min,室温)。8.2.10加500μL缓冲液Ⅱ封闭组织切片，37℃温浴30min。8.2.11用缓冲液Ⅱ将AP-抗DIG稀释至0.75U/μL(1pL0.75U/μLAP-抗DIG加到1mL缓冲液Ⅱ8.2.13吸500μL显色液于每张组织切片上，在暗处于室温放置1h～3h,随时观察显色情况，当阳性对照有明显显色或阴性对照开始普遍出现非特异性显色，立即终止显色。8.2.14把组织切片置于缓冲液IV中15min终止反应。8.2.16空气自然干燥后，滴加2滴中性树胶，封片。8.2.17显微镜下(400倍),寻找着色明显的蓝黑色杂交信号，并拍照。9结果判定9.1检测结果成立条件阳性对照样品组织病灶部位观察到明显的蓝黑色杂交信号，阴性对照样品组织中未观察到任何的9.2检测结果判定检测样品组织中观察到蓝黑色杂交信号(参见附录B),则原位杂交检测结果为阳性，判定为尼氏单孢子虫感染；待测样品组织中未观察到蓝黑色杂交信号，则原位杂交检测结果为阴性。牡蛎单孢子虫病及其主要病原简介参见附录C。6GB/T40251—202195%乙醇甲醛(37%)冰醋酸过滤海水95%乙醇加水定容至95%乙醇加水定容至95%乙醇加水定容至A.5500μg/mL多聚赖氨酸多聚赖氨酸(相对分子质量25000)加水定容至A.620×SSCNaClNa₃C₆H₅O₇·2H₂O加水溶解定容至调节pH至A.72×SSC20×SSC水(规范性)试剂配方330mL220mL335mL950mL700mL950mL500mL950mL900mL720×SSCA.90.5×SSC20×SSCA.10PBSNa₂HPO₄·12H₂O2.9gKH₂PO₄蛋白酶KA.12100μg/mL蛋白酶K10mg/mL蛋白酶K0.25mLPBS甲醛(37%)5.4mLA.14杂交缓冲液10mg/mL鲑精DNA2.5mL25%硫酸葡聚糖10mL8GB/T40251—2021加水定容至1000mL高压蒸气灭菌，4℃贮存。A.16缓冲液I10×缓冲液I100mLA.17缓冲液ⅡTritonX-1000.3g山羊血清2mL缓冲液I100mL在60℃~80℃水浴中溶解，不断晃动，直至颗粒溶解。4℃可贮存2周。A.1810×缓冲液ⅢNaCl58.4g加水溶解至800mL用浓HCl调节pH至9.5MgCl₂·6H₂O101.6g加水定容至1000mLA.19缓冲液Ⅲ10×缓冲液Ⅲ100mL水混匀，0.45μm滤膜过滤除菌，4℃贮存，出现沉淀后丢弃。A.2010×缓冲液NEDTA-Na₂·2H₂O3.7g用HCl调pH至8.0,高压灭菌。4℃贮存。A.21缓冲液IV10×缓冲液IV100mL水900mLA.2210%聚乙烯醇聚乙烯醇(相对分子质量30000～70000)10g加水溶解至100mL9A.23显色液缓冲液Ⅲ盐酸左旋咪唑10%聚乙烯醇4℃保存用前在每1mL上述混合液中加入：NBTA.240.5%俾斯麦棕Y俾斯麦棕Y水把染料溶于水中，过滤。室温贮存。A.25NBT贮存液NBT二甲基甲酰胺水A.26BCIP贮存液BCIP二甲基甲酰胺A.2720×丹哈特液牛血清白蛋白聚蔗糖400聚乙烯吡咯烷酮360加水溶解并定容至90mL500mL0.9310.402mLmL2mLgggmLA.2825%硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖加水定容至将鲑精DNA钠盐加入水中，用玻璃棒搅拌直至完全溶解。用6号针头的注射器反复抽打数次。在100℃水浴中加热10min,立即放于冰浴中淬冷，分装于无菌小试管中，-20℃保存。使用