蔬菜水果中克百威的检测 量子点微球荧光免疫层析法

蔬菜水果中克百威的检测量子点微球荧光免疫层析法范围本文件规定了蔬菜水果中克百威的量子点微球荧光免疫层析快速检测方法。本文件适用于辣椒、青菜、豇豆、芹菜、韭菜、黄瓜、苹果、柑橘和梨中克百威的快速检测。本方法检测克百威的检出限为0.0035mg/kg，定量限为0.0085mg/kg。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB2763食品安全国家标准食品中农药最大残留限量GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27417合格评定化学分析方法确认和验证指南NY/T788-2018农作物中农药残留试验准则术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。原理本方法以量子点微球为荧光标记物，基于竞争抑制免疫层析技术原理，通过荧光信号读取仪进行数据读取和分析，根据已设定的标准曲线计算样品中待测物质的含量，对蔬菜水果中的克百威进行半定量或定量检测。试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯水：应符合GB/T6682，二级水。克百威标准物质：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。乙腈（C2H3N）。磷酸氢二钾（K2HPO4）。磷酸二氢钾（KH2PO4）。样品提取液配置：准确称取5.6g磷酸氢二钾（5.4）、0.41g磷酸二氢钾（5.5），乙腈（5.3）100mL用水溶解并定容至1L。样本净化管：不同厂家材料可能不一致，本方法不做规定，目的为样本基质净化。样品稀释液配置（0.01mol/L磷酸盐缓冲液）：准确称取5.6g磷酸氢二钾（5.4）、0.41g磷酸二氢钾（5.5），用水溶解并定容至1L克百威标准品储存液（100mg/L）：准确称取克百威标准物质（5.2）10mg（精确至0.01mg），置于100mL容量瓶中，用乙腈（5.3）溶解并定容至刻度，摇匀后-20°C冷冻避光保存，有效期6个月。仪器和设备分析天平：感量分别为0.01g和0.01mg。微量移液器：20～200µL、100～1000µL和1～10mL。旋涡混合器：转速≥2500r/min。恒温孵育器：设定温度误差不超过±1度。荧光免疫分析仪：激发波长为365±5nm，发射波长为610±5nm。离心机：转速≥4000r/min。搅碎机：转速≥5000r/min。离心管：1.5mL和50mL。克百威量子点微球荧光免疫层析快速检测卡（含ID卡，内设对应批次标准曲线）。试样制备分样和粉碎取不少于100g具有代表性的蔬菜水果样品，充分均质混匀，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记，留样置于-20°C避光保存。蔬菜水果取样部位参考NY/T788-2018《农作物中农药残留试验准则》。试样前处理准确称取2g±0.1g样本于50mL离心管中。向上述离心管中依次加入样本提取剂3mL（5.6），盖上盖子漩涡混匀2min。取1mL提取后上清液到一支样本净化管（5.7）中，在漩涡振荡器上震荡混匀1min，4000rpm离心2min。取50µL离心后上清液加入700µL克百威样本稀释液（5.8），混匀后用于检测。注：不同厂家检测卡所用的样品前处理方法可能不同，应按照产品使用说明中规定方法进行操作。检测步骤测试前打开荧光免疫分析仪（6.5），确认试剂盒中的ID卡与试剂盒的批号是否匹配后插入ID卡，在仪器测试界面点击“读ID卡/读项目”，界面出现“读取完成”，点击“确认”即可使用。将恒温孵育器（6.4）开机，待温度升至37℃即可使用。从包装铝箔袋中取出检测卡，在半小时内使用。将检测卡平放，用微量移液器吸取90μL稀释后的待测液于检测卡的加样孔（S）中，在恒温孵育器中37℃孵育反应10min。反应时间结束后立即将检测卡插入读取仪中，点击仪器界面的“测试”，仪器会自动给出定量测试结果，15min后测试无效。注：不同厂家读卡仪所用仪器界面设置可能不同，应按照仪器使用说明中规定方法进行。9结果表述样品中克百威的含量由荧光分析仪自动计算并显示，单位为毫克/千克（mg/kg）。10其他本方法参比标准为GB23200.112《食品安全国家标准植物源性食品中9种氨基甲酸酯类农药及其代谢物残留量的测定液相色谱-柱后衍生法》。注：性能指标计算方法见附录A。附录A（资料性）产品性能指标计算A.1检出限和定量限通过对20个独立的空白样品进行测定，检出限以空白样品20次测定结果的均值加3倍标准偏差计算；定量限以空白样品20次测定结果的均值加10倍标准偏差计算。A.2准确度综合考虑目标分析物国家标准限量值或禁用目标分析物的参比方法定量限，制备低、中、高三个浓度水平的盲样，每个浓度水平进行至少6次重复实验。三个浓度水平的平均加标回收率应在70-130%（需讨论确定）。A.3重复性采用三批验证产品进行检测，每批至少6次重复测定中等浓度水平的样品，相对标准偏差（RSD）应小于15%。A.4特异性目标分析物及其结构类似物的标准品用缓冲液配制成系列梯度浓度，做出标准曲线，得出IC50（半抑制浓度）后按照式（1）计算交叉反应率。（1）A.5假阴性率在实验条件下达到的实际最低检