肿瘤类器官及药敏建立方法

荷兰胡布勒支研究所（HubrechtInstitute）隶属于荷兰皇家艺术与科学院（RoyalNetherlandsAcademyofArtsandSciences,KNAW）；研究所包括23个研究小组，对健康和病变的细胞、组织和生物体进行多学科的基础研究。研究方向主要涵盖了发育和干细胞生物学的许多方面，包括干细胞和早期发育的信号传递、心脏发育、再生、表观遗传学、基因组结构、细胞周期控制、DNA修复、基因表达动态和基因表达的定量生物学。Hubrecht发育生物学和干细胞研究所课题组长、马西玛公主儿科肿瘤中心课题组长，乌特勒支大学教授和Oncode研究员。HansClevers研究方向Wntsignaling:incancerandinadultstemcellsLgr5asadultstemcellmarker

andstemcellbiologyOrganoidsTechnologyKeyPublications通讯作者发表：Cell21篇

，Nature19篇

，Science10篇

基本流程培养过程IsolationmediumNormal（NLO）Tumor（HBO）DMEM/F12√√PS1%1%GlutaMax1%1%HEPES10mM10mMB27（withoutvitaminA）1:501:50N-acetylcysteine1.25mM1.25mMRspo1-conditionedmedium10%(vol/vol)（200ng/ml）---nicotinamide10mM10mM

recombinanthuman[Leu15]-gastrinI10nM10nMrecombinantmouseEGF50ng/ml50ng/mlrecombinanthumanFGF10100ng/ml100ng/mlrecombinanthumanHGF25ng/ml25ng/mlN2supplement

1:100

1:100Forskolin10µM10µMA83-015µM5µMrecombinanthumanNoggin25ng/ml---Wnt3a-conditionedmedium30%(vol/vol)（100ng/ml）---Rhokinase(ROCK)inhibitor(Y-27632)10µM10µMDexamethasone----3nMStoreat4°Cforupto2weeks4°Cforupto2weeks培养基培养基成份分为两类：1、基础培养基：DMEM/F12（适合克隆培养）；2、生长因子：（1）Wnt信号通路激活剂：Wnt信号配体和LGR5的配体Rspo-1等；（2）酪氨酸受体激酶的配体：EGF\FGF10\NGF等（刺激上皮细胞增殖）（3）TGF-β信号通路抑制剂：Noggin，A83-01（抑制上皮细胞分化）（4）Rhokinase（ROCK抑制剂）：Y-27632（保持干细胞多能性

）准备工作：胶BME（basementmembraneextract）\Matrigel\Geltrex基底膜提取物（BME）是从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)瘤细胞中纯化出来的一种可溶性的基底膜。提取胶在37度时能形成重组基底膜。BME主要组分包括：层粘连蛋白，胶原蛋白IV，巢蛋白和硫酸肝素蛋白多糖。BME通常用于维持干细胞或者前体细胞的未分化状态。不同研究组的消化和传代方法肠类器官肝类器官HNSCC类器官培养（共计89个步骤）1、Collectionandpreparationofprimaryhumantissuefororganoidculturegeneration●Timing1-24h

样本要含有上皮细胞，剔除坏死组织，脂肪及肌肉组织，坏死组织在颜色上呈黄色，非坏死组织呈现粉红色；组织样本取下后，迅速放进4℃的DMEM/F12培养基中，培养基中事先加入10μM的ROCK抑制剂Y-26732，保证细胞存活。组织需尽快处理，不能及时的处理的组织要保存在4℃冰箱；此时应预留部分组织，后期进行免疫组化等分子生物学实验。2、Establishmentoforganoidsfromprimarytissue●Timing2h

组织消化：机械破碎+酶消化Table1中提出了33种消化方法，29种用了胶原酶、10种用了胰酶，5种用了透明质酸酶，3种用了分散酶、DNA酶和EDTA；切勿消化过度，镜下观察出现2-10个细胞的细胞团时，即表示消化完全，过度消化影响PDO的活性；为了更好的形成类器官，作者建议在培养的时候保持添加Y-27632，保证细胞存活；BME要放置在冰上，防止凝固，不能过度稀释，提及占比应大于70%；2、Establishmentoforganoidsfromprimarytissue●Timing2h培养板要37℃提前热板24h，保证BME添加后能够迅速凝固，防止BME散开，细胞贴壁；添加培养基的时候不要直接滴到胶上，防止对胶的破坏，如果胶飘起来，需要离心重新混合BME胶再铺板；培养的时候，不要过早传代，应培养一段时间，过早传代会降低PDO的活率；发现污染，首先，用5MNaOH加入到污染孔中，放置1h，然后吸走弃去，用70%乙醇清洗污染孔，更换培养皿的盖子；定期做支原体等污染检测，对于容易污染的结肠和口腔肿瘤组织，建议培养基中除青链霉素外，再添加Primocin（原代细胞抗生素）、Vancomycin（万古霉素）和Gentamicin（庆大霉素）3、Splittingoforganoids●Timing1h机械吹打+TrypLE吹打BME胶，转移到15mL离心管中，加入冰上预冷的培养基去除BME胶；TrypLE消化PDO，不要超过15min，镜下实时监测，出现2-10个细胞的细胞团时，消化完全；当PDO出现囊状的或葡萄状的形态时，用机械吹打代替TrypLE；用于药敏实验的PDO，最好用第1、2代，多代后可能会产生基因突变，影响药敏结果；4、Freezingoforganoids●Timing30min–1h传代后2-3d时，冻存能够保证最好的复苏率；单个细胞或过大的分化完全的细胞团，往往会复苏不成功；4℃200g离心5分钟，沉淀PDO，用500μl冻存液重悬,加入到冻存管中，-80℃过夜，转移到液氮中；冻存复苏后的PDO容易发生形态上的变化，不建议用来做药敏实验。5、

Thawingofcryopreservedorganoids●Timing1h6、Preparationoforganoidsolutionfordispensationintoscreeningplates●Timingday3,1.5h药敏实验前，要对PDO进行评估，利用DNA测序等方法，确定PDO的确是肿瘤细胞而不是正常上皮细胞；制备PDO悬液，一定要确保BME胶被完全去除，如果镜下仍有低厚度玻璃状的小球，说明BME没有被完全去除，这时需要用ice-cold的DMEM/F12培养基去洗，每次洗之间要在冰上放10分钟，如此反复直到BME去除为止；最后重悬PDO的时候，完全培养基加5%的BME进行重悬，然后尽快上机把细胞分到384孔板中，防止时间过长PDO沉于管底。药敏筛选ThermoScientific™Multidrop™Combi自动分液器在0.5到2500μL范围内提供精确的分液，确保得到可重复的检测数据适用于6孔到1536孔板，板的高度从5到50mm8通道分液盒可拆卸，可高温高压灭菌，在Multidrop分液量程范围内提供标准分液HPD300eDigitalDispenser消除剂量反应工作流程中的连续稀释环节，微型化qPCR反应体积，并且在皮升到微升的范围内，都能准确地分配剂量，可满足众多低剂量分配应用的需求。细胞分液药物分液读数+数据处理7、Dispensationoforganoidsinto384-welldrug-screeningplates●Timingday3,20min在铺板前还有两个步骤：1、过滤。滤掉大的PDO，过大的PDO会导致读数不准，建议:40μm<PDO<70μm；2、计数。确保每一个孔里的PDO数目一致。检测要用黑边透底的384孔板，我们用的是黑边透底的96孔板；8、Additionofchemotherapeuticsintothecultureplate●Timingday3,20–30min孔板边缘不要用，防止边缘效应；设置阳性对照与阴性对照，阳性对照用星形孢菌素（staurosporin）处理，确保对细胞的全面杀伤，阴性对照用药物溶剂对照，数据处理时分别设置为0%与100%，对照是必须设置的，至少三个重复。DMSO体积不超过1%，PBS不超过2.5%，Tween-20不超过0.3%；每一块板至少要留下三个孔，来做阴性对照孔，排除培养板本身对药敏结果的影响；药敏实验的使用浓