(高清版)GBT 8381.3-2023 饲料中林可胺类药物的测定 液相色谱-串联质谱法

GB/T8381.3—2023代替GB/T8381.3—2005饲料中林可胺类药物的测定液相色谱-串联质谱法2023-08-06发布国家市场监督管理总局I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件代替GB/T8381.3—2005《饲料中林可霉素的测定》,与GB/T8381.3—2005相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：a)更改了适用范围(见第1章，2005年版的第1章);b)更改了原理(见第4章，2005年版的第4章);c)更改了试剂或材料(见第5章，2005年版的第5章);d)更改了仪器设备(见第6章，2005年版的第6章);e)更改了试验步骤(见第8章，2005年版的第8章);f)更改了试验数据处理(见第9章，2005年版的10.2)。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。本文件起草单位：浙江大学、浙江青莲食品股份有限公司。本文件主要起草人：王凤芹、汪以真、路则庆、冯杰、王腾浩、刘波静、程远之、靳明亮、王新霞、本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：——2005年首次发布为GB/T8381.3—2005;——本次为第一次修订。1饲料中林可胺类药物的测定液相色谱-串联质谱法1范围本文件描述了饲料中林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素的液相色谱-串联质谱测定方法。本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素的测定。本文件的检出限为10μg/kg、定量限为40μg/kg。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制备3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理试样中待测物用甲醇-磷酸盐缓冲溶液提取，经混合型强阳离子交换固相萃取小柱净化，液相色谱-串联质谱仪检测，外标法定量。5试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.5盐酸溶液：移取0.9mL盐酸，用水稀释至100mL,混匀。5.6磷酸盐缓冲溶液(pH8.0):称取11.411g三水磷酸氢二钾，加入430mL水溶解，用盐酸溶液(5.5)调节pH至8.0±0.1,用水稀释至500mL,混匀。5.7甲醇-磷酸盐缓冲溶液：取800mL甲醇(5.3),加入200mL磷酸盐缓冲溶液(5.6),混匀。5.8甲酸溶液I:取1mL甲酸(5.2),用水稀释至100mL,混匀。25.9甲酸溶液Ⅱ:取1mL甲酸(5.2),用水稀释至1000mL,混匀。5.10氨化甲醇溶液：取5mL氨水，用甲醇(5.3)稀释至100mL,混匀。5.11甲醇溶液：取50mL甲醇(5.3),用水稀释至100mL,混匀。5.12标准储备溶液(500μg/mL):分别称取盐酸林可霉素(CAS号：859-18-7,纯度≥98%)、盐酸克林霉素(CAS号：21462-39-5,纯度≥98%)、克林霉素磷酸酯(CAS号：24729-96-2,纯度≥98%)和盐酸吡利霉素(CAS号：78822-40-9,纯度≥98%)各适量(如所用标准品为相应的盐，则折算成有效成分)(精确至0.01mg),用甲醇(5.3)溶解并稀释定容，混匀，制成质量浓度均为500μg/mL的标准储备溶液。于一18℃以下保存，有效期3个月。5.13混合标准中间溶液(10μg/mL):准确移取标准储备溶液(5.12)各1mL于50mL容量瓶中，用甲醇(5.3)稀释并定容，混匀。于2℃~8℃保存，有效期7d。5.14混合标准系列溶液：准确移取混合标准中间溶液(5.13)适量，用甲醇溶液(5.11)配制成质量浓度分别为1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L和200μg/L的混合标准系列溶液。临用5.15混合型强阳离子交换固相萃取小柱：500mg/6mL,或性能相当者。6仪器设备6.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源(ESI)。6.2分析天平：精度0.01g和0.01mg。6.3离心机：转速不低于8000r/min。6.4超声波清洗仪。6.5固相萃取装置。7样品按GB/T20195制备试样。取样品至少200g,粉碎使其全部通过0.425mm孔径的分析筛，充分混8试验步骤平行做两份试验。称取2.5g(精确至0.01g)试样于50mL离心管中，准确加入25mL甲醇-磷酸盐缓冲溶液(5.7),涡旋混匀，超声提取15min,于8000r/min离心5min,取上清液于另一支50mL离心管中。重复提取一次，合并上清液，混匀。准确移取2.5mL(V₁)于10mL离心管中，加入2.5mL甲8.2净化依次用6mL甲醇(5.3)、6mL水和6mL甲酸溶液I(5.8)活化固相萃取小柱，备用液(8.1)全部过柱，分别用6mL甲酸溶液I(5.8)、6mL水和6mL甲醇(5.3)淋洗，抽干。用3mL氨化甲醇溶液3(5.10)洗脱，收集洗脱液于50℃氮气吹干，准确加入2.5mL(V₂)甲醇溶液(5.11),涡旋溶解，微孔滤膜8.3仪器参考条件8.3.1液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a)色谱柱：C₈色谱柱，柱长50mm,内径2.1mm,粒径1.7μm,或性能相当者；b)流动相：A——甲酸溶液Ⅱ(5.9),B——乙腈(5.4);c)梯度洗脱，洗脱程序见表1;表1梯度洗脱程序时间/minA/%B/%224.5228.3.2质谱参考条件质谱参考条件如下：a)电离方式：电喷雾电离，正离子模式(ESI+);b)检测方式：多反应监测(MRM);e)脱溶剂气流速：1000L/h;f)雾化气、干燥气为高纯氮气，碰撞气为高纯氩气或其他合适气体；g)监测离子对、锥孔电压和碰撞能量见表2。表2林可胺类药物的监测离子对、锥孔电压和碰撞能量参考值化合物母离子(m/z)子离子(m/z)锥孔电压/V碰撞能量/eV林可霉素407.4359.5克林霉素425.4377.44GB/T8381.3—2023表2林可胺类药物的监测离子对、锥孔电压和碰撞能量参考值(续)化合物母离子(m/z)子离子(m/z)锥孔电压/V碰撞能量/eV克林霉素磷酸酯505.2457.4吡利霉素411.2363.3”定量离子。8.4测定8.4.1标准系列溶液和试样溶液测定在仪器的最佳条件下，分别取混合标准系列溶液(5.14)和试样溶液上机测定。标准溶液的定量离子对色谱图见附录A。8.4.2定性在相同试验条件下，试样溶液中待测物的保留时间应与标准系列溶液(浓度相当)中待测物的保留时间一致，其相对偏差在±2.5%之内。根据表2选择的定性离子对，比较试样谱图中待测物监测离子对的相对离子丰度与浓度接近的标准系列溶液中对应的监测离子对的相对离子丰度，若最大允许偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%最大允许偏差/%8.4.3定量在仪器最佳工作条件下，混合标准系列溶液与试样溶液交替进样，采用外标法定量。以标准溶液中被测组分的峰面积为纵坐标，以标准溶液中被测组分的浓度为横坐标绘制标准工作曲线，标准曲线的相关系数应不低于0.99。试样溶液与标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。当试样的上机浓度超过线性范围时，需根据测定浓度稀释后进行重新测定。单点校准定量时，试样溶液中待测物的浓度与标准溶液浓度相差不超过30%。9试验数据处理点校准按式(2)计算：式中：p——从标准曲线查得的试样溶液待测物的质量浓度，单位为微克每升(μg/L);5GB/T8381.3—2023V——试样提取溶液的体积，单位为毫升(mL);V₂——上机前最终定容体积，单位为毫升(mL);n——超出线性范围后试样溶液的稀释倍数；V₁——移取上清液的体积，单位为毫升(mL);m——试样的质量，单位为克(g)。 (2)式中：A——试样溶液中待测物的色谱峰面积；p、——标准工作液中待测物的质量浓度，单位为微克每升(μg/L);V——试样提取溶液的体积，单位为毫升(mL);V₂——上机前最终定容体积，单位为毫升(mL);n——超出线性范围后试样溶液的稀释倍数；A、——标准工作液中待测物的色谱峰面积；V₁——移取上清液的体积，单位为毫升(mL);测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。10