蛋白质的结构和功能上学期省公开课金奖全国赛课一等奖微课获奖课件

蛋白质结构与功效第一章StructureandFunctionofProtein1/112本章教学重点蛋白质元素组成特点，氨基酸结构通式，氨基酸分类、三字英文缩写符号；

肽、肽键概念；

蛋白质一、二、三、四级结构概念及其稳定主要化学键；二级结构主要形式；蛋白质结构与功效关系；变构效应概念；蛋白质两性电离，胶体性质，蛋白质变性概念和意义，紫外吸收和呈色反应；模体、结构域、分子伴侣概念；盐析、电泳和分子筛效应原理。2/112蛋白质(protein)是由许多氨基酸(aminoacids)经过肽键(peptidebond)相连形成高分子含氮化合物。概述一、什么是蛋白质?3/112二、蛋白质生物学主要性1.蛋白质是生物体主要组成成份分布广：全部器官、组织都含有蛋白质；细胞各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富有机分子，占人体干重45％，一些组织含量更高，比如脾、肺及横纹肌等高达80％。4/1121）作为生物催化剂（酶）2）代谢调整作用3）免疫保护作用4）物质转运和存放5）运动与支持作用6）参加细胞间信息传递2.蛋白质含有主要生物学功效3.氧化供能5/112第一节蛋白质分子组成TheMolecularComponentofProtein6/112

组成蛋白质元素主要有C、H、O、N和S。

有些蛋白质含有少许磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘。7/112各种蛋白质含氮量很靠近，平均为16％。

因为体内含氮物质以蛋白质为主，所以，只要测定生物样品中含氮量，就能够依据以下公式推算出蛋白质大致含量：100克样品中蛋白质含量(g%)=每克样品含氮克数×6.25×1001/16%

蛋白质元素组成特点8/112一、氨基酸(aminoacid，AA/aa)

——组成蛋白质基本单位存在自然界中氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质氨基酸仅有20种，且均属L-氨基酸（甘氨酸除外）。9/112H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸通式R10/112非极性脂肪族氨基酸极性中性氨基酸芳香族氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸（一）氨基酸分类*20种氨基酸英文名称、缩写符号及分类以下:｝11/112(一)侧链含烃链氨基酸(非极性脂肪族氨基酸)12/112(二)侧链有极性但不带电荷氨基酸(极性中性氨基酸)13/112(三)侧链含芳香基团氨基酸(芳香族氨基酸)14/112(四)侧链含负性解离基团氨基酸(酸性氨基酸)15/112(五)侧链含正性解离基团氨基酸(碱性氨基酸)16/112几个特殊氨基酸脯氨酸（亚氨基酸）17/112

半胱氨酸+胱氨酸二硫键-HH18/112（二）氨基酸理化性质1.两性解离及等电点氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液酸碱度。等电点(isoelectricpoint,pI)

在某一pH溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液pH值称为该氨基酸等电点。19/112pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸兼性离子阳离子阴离子20/112依据酸碱基团解离常数(pKa)可计算氨基酸pI中性氨基酸pI酸性氨基酸pI碱性氨基酸pI21/1122.紫外吸收芳香族氨基酸紫外吸收Trp、Tyr(含共扼双键)最大吸收峰在280nm附近。大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm光吸收值是分析溶液中蛋白质含量快速简便方法。22/1123.茚三酮反应氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。因为此吸收峰值与氨基酸含量存在正比关系，可作为氨基酸定量分析方法。23/112二、肽*肽键(peptidebond)是由一个氨基酸

-羧基与另一个氨基酸

-氨基脱水缩合而形成化学键。（一）肽(peptide)*肽是由氨基酸经过肽键缩合而形成化合物。24/112+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键25/112*

两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……*肽链中氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。*

由十个以内氨基酸相连而成肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多氨基酸相连形成肽称多肽(polypeptide)。26/112N末端：多肽链中有自由氨基一端C末端：多肽链中有自由羧基一端多肽链有两端*多肽链(polypeptidechain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成一个结构。27/112N末端C末端牛核糖核酸酶28/112（二）几个主要生物活性肽

1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)29/112GSH过氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH还原酶NADPH+H+NADP+GSH与GSSG间转换30/112

体内许多激素属寡肽或多肽神经肽(neuropeptide)2.多肽类激素及神经肽31/112第二节TheMolecularStructureofProtein蛋白质分子结构32/112蛋白质分子结构包含

一级结构(primarystructure)二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)高级结构33/112定义蛋白质一级结构指多肽链中氨基酸排列次序。一、蛋白质一级结构主要化学键肽键，有些蛋白质还包含二硫键。34/112一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功效基础，但不是决定蛋白质空间构象唯一原因。35/112二、蛋白质二级结构蛋白质分子中某一段肽链局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子相对空间位置，并不包括氨基酸残基侧链构象

。定义

主要化学键：

氢键

36/112（一）肽单元(肽单位)参加肽键6个原子C

1、C、O、N、H、C

2位于同一平面，C

1和C

2在平面上所处位置为反式(trans)构型，此同一平面上6个原子组成了所谓肽单元(peptideunit)

。57°47°37/112蛋白质二级结构主要形式

-螺旋(

-helix)

-折叠(

-pleatedsheet)

-转角(

-turn)

无规卷曲(randomcoil)

38/112（二）

-螺旋肽段主链围绕中心轴做有规律螺旋式上升,螺旋走向为顺时针(右手螺旋).肽单位(肽平面)围绕N-Cα

键旋转57°(Phi角)或绕C-Cα键旋转47°(Psi角).氨基酸侧链伸向螺旋外侧.每3.6个氨基酸残基上升一圈(360°),螺距为0.54nm.每个肽键N-H和第四个肽键C=O形成与长轴平行氢键.2Cα

间距0.15nm39/11240/112影响

-螺旋形成原因氨基酸结构刚性(Pro)氨基酸形成离子键或静电斥力(Glu/Asp/His/Lys/Arg)氨基酸侧链大小(Val/Ile)41/112（三）

-折叠42/112

-折叠特点:伸展(2C

间距离达0.35nm

)瘦长/弯曲/桶状，两链同向或反向在不一样链或同一条链不一样片段形成氢键侧链突出在折叠上方或下方强度大,有刚性43/112（四）

-转角和无规卷曲

-转角无规卷曲是用来阐述没有确定规律性那部分肽链结构。44/112Betaturn﹡usuallyconsistsof4AAresidues;﹡TheH-bondisformedbythe1stAA’sC=Oandthe4thAA’sN-H;﹡The2thresidueusuallyisPro(sometimeGly,Asp,Asn,Trp)﹡Hairpinshape﹡Reversedirection﹡Oftenfoundconnectingtheendsofantiparallel45/112（五）模体(超二级结构)在许多蛋白质分子中，二个或三个含有二级结构肽段，在空间上相互靠近所形成有规则二级结构组合，被称为模体(motif)。模体是赋予功效含义超二级结构。二级结构组合形式如：αα，βαβ，ββ。46/112

47/112钙结合蛋白中结合钙离子模体锌指结构48/112（六）氨基酸残基侧链对二级结构形成影响蛋白质二级结构是以一级结构为基础。一段肽链其氨基酸残基侧链适合形成

-螺旋或β-折叠，它就会出现对应二级结构。49/112theconformationalpreferencesofthe20AAsforthealpha-helixGlu、Met、Ala、LeuLys、Phe、Gln、Trp、Ile、ValAsp、HisCys、Ser、Thr、ArgAsn、TyrGly、ProStrongWeakWeak(usuallyfoundinthebeta-reverseturn)50/112三、蛋白质三级结构疏水键、离子键、氢键和VanderWaals力等。主要化学键整条肽链中全部氨基酸残基相对空间位置。即肽链中全部原子在三维空间排布位置。（一）定义51/112肌红蛋白(Mb)三级结构N端

C端52/11253/112纤连蛋白分子结构域（二）结构域(domain)较大蛋白质分子中折叠形成

结构较为紧密具独特空间构象并各行其功效局部区域称之54/112（三）分子伴侣(chaperon)是为加速蛋白质折叠整天然构象或形成四级结构提供适当微环境一类蛋白质。*热休克蛋白70(Hsp70)*伴侣蛋白(chaperonin)(如Hsp60/GroEL、GroES)*核质蛋白(nucleoplasmin)55/112*分子伴侣可逆地与未折叠肽段疏水部分结合随即松开，如此重复进行可预防错误聚集发生，使肽链正确折叠。*分子伴侣也可与错误聚集肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。*分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键正确形成起了主要作用。56/112伴侣蛋白在蛋白质折叠中作用57/112亚基之间结协力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。四、蛋白质四级结构蛋白质分子中各亚基空间排布及亚基接触部位布局和相互作用，称为蛋白质四级结构。有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整三级结构，称为蛋白质亚基(subunit)。58/112由2个亚基组成蛋白质四级结构中，若亚基分子结构相同，称之为同二聚体(homodimer)，若亚基分子结构不一样，则称之为异二聚体(heterodimer)。血红蛋白四级结构59/112五、蛋白质分类*依据蛋白质组成成份单纯蛋白质结合蛋白质=蛋白质部分+非蛋白质部分*依据蛋白质形状纤维状蛋白质球状蛋白质辅基(prostheticgroup)色素/寡糖/脂类/磷酸/金属离子/核酸等60/112六、蛋白质组学（一）蛋白质组学基本概念蛋白质组是指一个细胞或一个生物所表示全部蛋白质，即“一个基因组所表示全套蛋白质”。61/112（二）蛋白质组学研究技术平台蛋白质组学是高通量，高效率研究:双向电泳分离样品蛋白质蛋白质点定位、切取蛋白质点质谱分析（三）蛋白质组学研究科学意义说明生命在生理或病理状态下改变规律疾病诊疗、新药筛选、农业、环境保护等62/112蛋白质结构与功效关系TheRelationofStructureandFunctionofProtein第三节63/112（一）一级结构是空间构象基础一、蛋白质一级结构与功效关系牛核糖核酸酶一级结构二硫键64/112天然状态，有催化活性尿素、β-巯基乙醇去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性牛核糖核酸酶65/112（二）一级结构相同蛋白质含有相同高级结构与功效胰岛素氨基酸残基序号A5A6A10B30人ThrSerIleThr猪ThrSerIleAla狗ThrSerIleAla兔ThrGlyIleSer牛AlaGlyValAla羊AlaSerValAla马ThrSerIleAla66/112（三）氨基酸序列提供主要生物化学信息一些广泛存在于生物界蛋白质如细胞色素(cytochromeC)，比较它们一级结构，能够帮助了解物种进化间关系。同一个蛋白质一级结构差异愈小，物种间进化愈靠近（如人与黑猩猩、人与猴、人与酵母）67/112（四）主要蛋白质氨基酸序列改变可引发疾病例：镰刀形红细胞贫血N-val·his·leu·thr·pro·glu

·glu·····C(146)HbSβ肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val·glu·····C(146)这种由蛋白质分子发生变异所造成疾病，称为“分子病”。68/112二、蛋白质空间结构与功效关系（一）Hb亚基与Mb结构相同，都含有运输氧气功效肌红蛋白/血红蛋白含有血红素辅基血红素结构69/112肌红蛋白(myoglobin，Mb)肌红蛋白是一个只有三级结构单链蛋白质，有8段α-螺旋结构。血红素分子中两个丙酸侧链以离子键形式与肽链中两个碱性氨基酸侧链上正电荷相连，加之肽链中F8组氨酸残基还与Fe2+形成配位结合，所以血红素辅基与蛋白质部分稳定结合。70/112血红蛋白(hemoglobin，Hb)血红蛋白含有4个亚基组成四级结构，每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧。Hb亚基之间经过8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水球状蛋白。71/112Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb百分数（称百分饱和度）随O2浓度改变而改变。（二）血红蛋白亚基构象改变可影响亚基与氧结合72/112Mb和Hb氧解离曲线73/112*协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中其它亚基与配体结合能力现象，称为协同效应。假如是促进作用则称为正协同效应

(positivecooperativity)假如是抑制作用则称为负协同效应

(negativecooperativity)74/112Deoxy-HbOxy-Hb75/112O2血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环小孔中，继而引发肽链位置变动。76/112变构效应(allostericeffect)蛋白质空间结构改变伴随其功效改变，称为变构效应。77/112（三）蛋白质构象改变与疾病

蛋白质构象疾病：若蛋白质折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质构象发生改变，仍可影响其功效，严重时可造成疾病发生。78/112蛋白质构象改变造成疾病机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀病理改变。这类疾病包含：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。79/112疯牛病中蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引发一组人和动物神经退行性病变。正常PrP富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质作用下可转变成全为β-折叠PrPsc，从而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折叠正常疯牛病80/112第四节蛋白质理化性质ThePhysicalandChemicalCharactersofProtein81/112一、蛋白质两性电离

蛋白质分子除两端氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中一些基团，在一定溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷基团。*蛋白质等电点(isoelectricpoint,pI)

当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液pH称为蛋白质等电点。82/112（二）蛋白质胶体性质

蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至数百万kD，其分子直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。*蛋白质胶体稳定原因颗粒表面电荷水化膜83/112+++++++带正电荷蛋白质－－－－－－－－带负电荷蛋白质在等电点蛋白质水化膜++++++++带正电荷蛋白质－－－－－－－－带负电荷蛋白质不稳定蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质聚沉84/112（三）蛋白质变性、沉淀和凝固*蛋白质变性(denaturation)在一些物理和化学原因作用下，其特定空间构象被破坏，也即有序空间结构变成无序空间结构，从而造成其理化性质改变和生物活性丧失。（二硫键、非共价键破坏，溶解度降低，黏度增加，不易结晶，易沉淀，易被蛋白酶水解，生物学活性丧失）85/112造成变性原因如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。

变性本质——破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质一级结构。86/112应用举例临床医学上，变性原因常被应用来消毒及灭菌。另外,预防蛋白质变性也是有效保留蛋白质制剂（如疫苗等）必要条件。

87/112若蛋白质变性程度较轻，去除变性原因后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有构象和功效，称为复性(renaturation)

。88/112天然状态，有催化活性尿素、β-巯基乙醇去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性89/112*蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融合相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。*蛋白质凝固作用(proteincoagulation)

蛋白质变性后絮状物加热可变成比较坚固凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。

90/112（四）蛋白质紫外吸收因为蛋白质分子中含有共轭双键酪氨酸和色氨酸，所以在280nm波优点有特征性吸收峰。蛋白质OD280与其浓度呈正比关系，所以可作蛋白质定量测定。91/112（五）蛋白质呈色反应⒈茚三酮反应(ninhydrinreaction)

蛋白质经水解后产生氨基酸也可发生茚三酮反应。⒉双缩脲反应(biuretreaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，展现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。92/112△93/112Peptidesandproteins(long-chainpolypeptides)reactwithCu2+inalkalinitytocreateablueviolet/redcolor.Thepeptidemusthaveatleast2peptidebonds.So,aminoacids…94/112第五节蛋白质分离纯化与结构分析TheSeparationandPurificationandStructureAnalysisofProtein95/112一、透析及超滤法*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开方法。*超滤法

应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量超滤膜，到达浓缩蛋白质溶液目标。96/112二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀

*使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量普通10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应马上分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。*盐析(saltprecipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，造成蛋白质沉淀。97/112*免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可取得抗该蛋白特异抗体。利用特异抗体识别对应抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物性质，可从蛋白质混合溶液中分离取得抗原蛋白。98/112三、电泳蛋白质在高于或低于其pI溶液中为带电颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种经过蛋白质在电场中泳动而到达分离各种蛋白质技术,称为电泳(elctrophoresis)

。依据支撑物不一样，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。

99/112几个主要蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，惯用于蛋白质分子量测定。*等电聚焦电泳，经过蛋白质等电点差异而分离蛋白质电泳方法。*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究主要技术。100/112四、层析层析(chromatography)分离蛋白质原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，依据溶液中待分离蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力