影响免疫组化染色的因素及对策

关于影响免疫组化染色的因素及对策良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。第2页,共32页，2024年2月25日，星期天一、影响免疫组化染色质量的因素1、标本的固定手术标本的及时固定是保证免疫组化染色质量的关键。未能及时固定的组织，会造成细胞的变性和自溶，导致结构的破坏和抗原物质的弥散，在免疫组化染色上表现为抗原定位的变化和背景染色的增高。过度的固定会造成抗原决定簇的封闭和抗原的丢失。第3页,共32页，2024年2月25日，星期天同一病例的ER表达情况ERER固定不及时固定二周后取材固定8小时后取材第4页,共32页，2024年2月25日，星期天未及时固定的乳腺癌组织ER表达胞浆着色第5页,共32页，2024年2月25日，星期天影响免疫组化染色质量的因素2、切片质量的影响切片太厚、皱褶，刀痕，敷贴不牢固，以及脱蜡不彻底，均会影响免疫组化的染色质量，易出现非特异性染色和染色不均匀。第6页,共32页，2024年2月25日，星期天影响免疫组化染色质量的因素3、抗原修复环节的影响抗原修复环节在免疫组化染色中是极为重要的环节。不同的修复时间、不同的修复方法、不同的抗原修复液，最终的结果会有差异。第7页,共32页，2024年2月25日，星期天同一蜡块不同修复方式的结果ERHer-2(2+)Her-2(1+)微波修复水浴修复第8页,共32页，2024年2月25日，星期天同一蜡块不同修复时间的结果第9页,共32页，2024年2月25日，星期天同一蜡块使用不同修复液的结果Ki-67EDTA柠檬酸第10页,共32页，2024年2月25日，星期天4、操作过程中细节问题的影响滴加抗体未完全覆盖组织，PBS残留过多，操作过程中切片干燥等原因，会出现边缘效应和染色不均匀及北京染色等。第11页,共32页，2024年2月25日，星期天抗体覆盖组织不完全造成的边缘效应第12页,共32页，2024年2月25日，星期天抗体覆盖不均匀的灶状着色第13页,共32页，2024年2月25日，星期天影响免疫组化染色质量的因素5、第一抗体、检测系统的影响使用不同克隆、不同种属来源的抗体，不同的检测系统，免疫组化的染色会产生差异。使用三步法试剂盒（如SP法）生物素系统进行免疫组化染色时，如果操作不当会产生较强的背景染色。第14页,共32页，2024年2月25日，星期天影响免疫组化染色质量的因素6、显色剂、复染剂的影响不同的DAB显色试剂盒、不同的显色时间，会对免疫组化染色强度及级别判断产生影响。苏木素复染过深、过浅，对比都不清晰。第15页,共32页，2024年2月25日，星期天DAB显色恰当GST-π第16页,共32页，2024年2月25日，星期天DAB显色恰当CK5/6第17页,共32页，2024年2月25日，星期天Ki-67第18页,共32页，2024年2月25日，星期天胸腔积液离心包埋细胞块的免疫组化染色TTF-1CK7第19页,共32页，2024年2月25日，星期天Calponin第20页,共32页，2024年2月25日，星期天TOPOⅡ第21页,共32页，2024年2月25日，星期天CK5/6第22页,共32页，2024年2月25日，星期天P63第23页,共32页，2024年2月25日，星期天DAB显色适当，苏木素复染过浅第24页,共32页，2024年2月25日，星期天二、免疫组化染色的质量控制组织固定1、标本在离体后应立即浸泡于相当于标本体积8~10倍的标准固定液中，大标本要剖开固定。离体后标本固定前存放不得超过30分钟。2、在实际工作中，就可操作性而言，10%的缓冲福尔马林是兼顾保存组织形态和抗原性通行的、被广泛接受的选择。3、适度、适时的固定。一般而言，大标本只要做到及时切开固定，在室温下12小时即可达到固定要求；为了适应免疫组化染色标准化的需要，标本固定后应及时取材，通常固定时间不得超过24小时。4、达到固定时间要求而不能及时进入脱水程序的标本，建议将标本置入70%的乙醇中进行暂时保存直至进入组织脱水程序。第25页,共32页，2024年2月25日，星期天免疫组化染色的质量控制脱水及制片1、建立严格的组织脱水试剂规范化更换制度，保证组织处理质量。2、切片厚度一般3~4µm，厚薄均匀、平整，无刀痕、折叠，采用高质量防脱载玻片。3、切片在60℃烤箱内烤2~3小时，或者70℃烤箱内1小时。4、脱蜡要和常规切片分开，使用单独的二甲苯，如果温度过低或二甲苯使用次数较多，可适当延长脱蜡时间。第26页,共32页，2024年2月25日，星期天免疫组化染色的质量控制抗原修复抗原修复的方式有多种，热修复一般推荐高压锅热修复法，但是微波修复也有其方便的一面。影响抗原修复的基本因素是加热的温度和加热的时间，以及所使用的修复液的PH值。需要操作者在实际工作中摸索总结，同时要根据每种抗体的具体要求，找到较适合的修复方式。抗原修复的恰当与否，直接关系到免疫组织化学染色的成败，进一步影响最后结果的正确判读。第27页,共32页，2024年2月25日，星期天免疫组化染色的质量控制抗体及检测系统的选择选择优良的抗体和检测试剂盒，新买抗体要进行敏感性测试，找到最佳的抗原修复条件，每次试验要设置相应的阳性和阴性对照。试剂的使用一定在其有效期内，同时经常观察抗体使用过程中的结果变化，如不理想要及时更换。第28页,共32页，2024年2月25日，星期天免疫组化染色的质量控制显色和复染不要忽视显色过程，和常规染色类似，显色不恰当也会造成染色的前功尽弃。不同的组织、不同的抗体显色时间有差异，必要时使用显微镜观察切片的显色效果。苏木素复染过深过浅都会造成对比不清晰，不利于观察评价。第29页,共32页，2024年2月25日，星期天免疫组化染色的质量控制影响免疫组化染色的因素很多。在操作中应注重细节，避免随意性，严格按照技术流程规范化操作，一个小的细节的疏忽或随意性操作，都可能会对免疫组化染色造成明显的影