细胞培养基本知识

细胞室准备室：用于进行培养器皿清楚、包装、培养物质准备和消毒以及供给物品保藏等.缓冲间：为了降低将外界污染源头带入培养室培养室：是专门用于进行细胞培养和各种无菌操作试验室。其基本条件是：清洁、无菌、干燥、不通风，并含有适宜光线。细胞培养基本知识第1页体外培养设备和器具超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、液氮保留罐、离心机、水纯化装置、高压蒸汽消毒装置、酶标仪过滤除菌装置、手术器械、培养器皿、移液器细胞培养基本知识第2页超净工作台

利用鼓风机驱动空气经过高效空气微粒滤层净化后，渐渐经过工作台面，在操作区形成无菌环境。按气流方向不一样分为：1.外流式，2.侧流式细胞培养基本知识第3页CO2培养箱CO2培养箱设定条件为37℃，5％CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意问题：

①使用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以确保通气。②保持培养箱内空气洁净。定时消毒。③箱内灭菌蒸馏水3升，以保持箱内湿度，防止培养液蒸发。细胞培养基本知识第4页自动双重纯水蒸馏器细胞培养基本知识第5页培养器皿一次性培养瓶和培养板：普通朔料培养器皿细胞生长面带负电荷，有利于大多数表面带正电荷细胞贴壁生长玻璃培养瓶、溶液瓶、移液管细胞培养基本知识第6页惯用玻璃器皿清洗浸泡：在5%稀盐酸溶液中浸泡12h以上，以到达软化器皿表面所附着物质，并中和器皿表面碱性物质。刷洗：用软毛毛刷将浸泡后其面在洗涤剂水中重复刷洗，以除去表面杂质。浸酸：利用强氧化作用去除器皿表面可能残留有机物,时间在6小时以上最好过夜。冲洗：重复注满水、倒空达20次以上。最终用二次水浸洗2～3次，烘干后包装。细胞培养基本知识第7页清洁液配制细胞培养基本知识第8页胶塞和塑料用具清洗先在水中浸泡，然后用2%NaOH溶液煮沸10分钟，自来水冲洗晾干后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟，最终分别用自来水和三次水各冲洗3次，烘干备用。细胞培养基本知识第9页过滤除菌装置1.不锈钢板式滤器：2.微孔滤膜滤器：有可换膜式滤器和一次性滤器两大类。细胞培养基本知识第10页细胞培养概念原代培养：就是首次培养，即培养物一经接种到培养皿中就不再分割，任其生长繁殖而不更换生长器皿。它包含：细胞培养、组织培养、器官培养。传代培养：伴随培养时间延长、细胞分裂繁殖，细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度逐步减慢甚至停顿，在这种情况下，都需要将培养物分割成小培养。细胞培养基本知识第11页原代培养细胞生命归宿原代培养期传代培养期衰退期细胞培养基本知识第12页体外细胞培养物生长类型贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。细胞培养基本知识第13页每代贴附生长细胞生长过程游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束潜伏期：此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。对数生长久：细胞数随时间改变成倍增加，活力最正确，最适合进行试验研究。停顿期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。其机制：接触抑制、密度依赖性。细胞培养基本知识第14页细胞培养基本知识第15页细胞培养基本知识第16页传代方法依据细胞生长恃点，传代方法有3种。1.悬浮生长细胞传代

离心法传代：离心（1000r/min）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2.半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）这类细胞部分展现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3.贴壁生长细胞传代采取酶消化法传代。惯用消化液有0.25％胰蛋白酶细胞培养基本知识第17页贴壁生长细胞传代方法1.吸光培养瓶中培养液,用PBS溶液清洗2-3次。2.加入1-2ml0.25％胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10min（显微镜下动态监测）。3.吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4.用吸管吸收瓶内培养液，重复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5.吸收1/10—1/40细胞悬液，接种于新培养瓶内。6.加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液新培养瓶内。7.将后者放入培养箱中培养。细胞培养基本知识第18页培养细胞生长条件1.细胞营养需要2.细胞生存环境温度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4渗透压3无污染4无毒细胞培养基本知识第19页细胞培养用液水：新鲜配置三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+缓冲液PBS：NaCl8.00gKCl0.20gNa2HPO4·H2O1.56gKH2PO40.20g加水至1000mlPH值调至7.2-7.4细胞培养基本知识第20页消化液1.胰蛋白酶：主要用是0.25％胰蛋白酶液，胰蛋白酶是一个黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+PBS缓冲液配制，过滤除菌。它作用于与赖氨酸或精氨酸相连接肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。浓度越高，作用越强，但超出一定程度会损伤细胞。用含血清培养液终止其消化作用。2.EDTA：是一个化学螯合剂，对细胞有一定解离作用。毒性小、价格廉价、使用方便。3.胶原酶溶液：又称羧肽酶，有胶原酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型及肝细胞专用胶原酶5种，可依据制备不一样组织细胞悬液选择不一样类型胶原酶细胞培养基本知识第21页培养基

培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长溶液，分天然培养基和合成培养基。细胞培养基本知识第22页1.天然培养基：有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成份丰富，培养效果好缺点：起源受限，成份复杂，影响对一些试验产物提取和试验结果分析，易发生支原体污染。2.合成培养基：是依据细胞生存所需物质种类和数量，用人工方法模拟合成。主要成份是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。缺点：缺乏一些成份，不能完全满足体外细胞生长需要，还需补充一定量天然培养基（如血清）细胞培养基本知识第23页惯用血清有：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。细胞培养基本知识第24页血清中含有：各种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）各种金属离子；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。各种生长因子转移蛋白不明成份细胞培养基本知识第25页普通说来．含5％小牛血清培养基对大多数细胞能够维持细胞不死．但支持细胞生长普通需加10％血清．对于血清支持细因生长生物学效应已得到证实，但对血清中复杂成份至今还未完全清楚。血清中不但存在促细胞生长因子，同时也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，所以在含血清培养基中培养细胞所反应生物学特征是细胞和复杂血清因子综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表示调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞细胞培养基本知识第26页血清质量好坏是试验成败关键。惯用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟血清消毒：过滤除菌细胞培养基本知识第27页抗菌素使用在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在细菌生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定细胞培养基本知识第28页完全培养基组成基础培养基80％～95％血清5％～20％HEPES、碳酸氢钠按培养基类型添加青、链霉素各100单位／毫升细胞培养基本知识第29页RPMI-1640培养基配制：RPMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠2.2gHEPES2.385g青、链霉素各100单位／毫升加三蒸水至1000ml,过滤除菌。调整pH值至7.2-7.4加血清（终浓度10％）细胞培养基本知识第30页细胞冻存和复苏冷冻保留就是将体外培养物悬浮在加有冷冻保护剂溶液中，以一定冷冻速率降至超低温条件，并在此温度下对其长久保留过程。复苏是一定复温速率将冻存培养物回复到常温过程。冻存和复苏标准：慢冻快融当细胞冷到零度以下，细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。假如迟缓冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大冰晶。大结晶会造成细胞膜、细胞器损伤和破裂。复苏过程应快融，目标是预防小冰晶形成大冰晶，即冰晶重结晶。细胞培养基本知识第31页慢冻程序标准程序：当温度在-25℃以上时，1～2℃/min当温度达-25℃以下时，5～10℃/min当温度达-100℃时，可快速放入液氮中简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，经过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。细胞培养基本知识第32页低温保护剂应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提升冻存效果。惯用低温保护剂是DMSO，它是一个渗透性保护剂，可快速透入细胞，提升胞膜对水通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，降低胞内冰晶，从而降低冰晶对细胞损伤。细胞培养基本知识第33页细胞冻存方法1.冻存液配制：含20%血清培养基,10%

DMSO2.取对数生长久细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×106～5

×106细胞/ml)3.加入1ml细胞于冻存管中，密封后标识冷冻细胞名称和冷冻日期。4.年后，存活率可达80％以上。DMSO液用培养液配好，5.防止因暂时配制产热而伤害细胞。对人造血干细胞研究证细胞培养基本知识第34页细胞复苏方法1.从液氮中取出冷冻管，快速投入37~38

℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。2.5分钟内用培养液稀释至原体积10倍以上。3.低速离心10分钟。4.去上清，加新鲜培养液培养刚复苏细胞。细胞培养基本知识第35页培养细胞活力测定任何培养瓶内生长细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区分死、活细胞是困难。细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广技术伎俩之一。

1.细胞克隆形成率试验2.台盼蓝法3.四唑盐（MTT）比色法细胞培养基本知识第36页1.细胞克隆形成率试验：

单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成细胞群体形成肉眼可见克隆。克隆形成卒用来表示细胞增殖能力。克隆形成率比＝克隆形成数／接种细胞数缺点：操作繁琐优点：准确、可靠细胞培养基本知识第37页2.台盼蓝法活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中百分比表示细胞活力。血细胞计数器：手工计数细胞细胞培养基本知识第38页3.四唑盐（MTT）比色法

MTT名为噻唑蓝，其原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功效。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含蓝紫色产物量成正比。再用酶标仪测定OD值MTT法简单快速