微生物分类与鉴定专题知识讲座

2024/4/181主要内容一、微生物分类单位二、微生物命名三、微生物分类依据四、分类方法五、微生物判定六、微生物惯用分类系统微生物分类与鉴定专题知识讲座第1页2024/4/182一、微生物分类单位

1.微生物分类目标：把各种微生物按照它们亲缘关系分群归类，排成条理清楚系统，方便于人们对微生物进行判定和交流。

2.

微生物分类任务：分类:经过搜集大量描述相关个体文件资料，经过归纳，整理成一个科学分类系统。

判定:经过详细观察和描述一个未著名称纯种微生物各种性状特征，然后查找现成分类系统，以到达对其知类，辨名目标。命名:是为新发觉微生物确定新学名。

微生物分类与鉴定专题知识讲座第2页2024/4/1833.通用分类单元种以上系统分类单元界

Kingdom(拉：Regnum)

门

Phylum(拉：Phylum)或Division(拉：Divisio)—亚门

纲

Class(拉：Classis)—亚纲

—超目

目

Order(拉：Ordo)—亚目科

Family(拉：Familia)—亚科 —族

—亚族

属

Genus(拉：Genus)

种Species(拉：Species)微生物分类与鉴定专题知识讲座第3页2024/4/1844.种概念种是一个基本分类单位定义：种是一大群表型特征高度相同、亲缘关系极其靠近、与同属内其它种有显著差异菌株总称。或定义亲缘关系较近微生物有机体集合，它们在进化发育阶段上有一定共同形态和生理特征。当代分类学上要求种内菌株DNA同源性≧70%。模式种：在微生物中，一个种只能用该种内一个经典菌株作为详细标本，它就是该种模式种。新种：sp.nov.或nov.sp.，新被判定种发表时应在其学名后标上sp.nov.符号，新种发表前应将其模式菌株培养物存放在一个永久性保藏机构，并应允许人们从中取得。微生物分类与鉴定专题知识讲座第4页2024/4/185亚种(小种race)（subspecies）：试验室中取得微生物变异型称为小种或亚种。或定义：普通指其某一稳定特征种与模式种中不一样种,常在种名、属名名词后写上subsp.然后再写详细亚种名词。变种（variety）：从自然界分离到微生物纯种，假如与经典种之间存在一些特征差异，而这些特征又是稳定遗传，则可将这一纯种称为经典种变种。如枯草芽孢杆菌黑色变种(在酪氨酸培养基上产黑色素)。是亚种同义词（1975）已要求它在命名法中没有地位。5.种以下分类单元微生物分类与鉴定专题知识讲座第5页2024/4/186

菌株（品系)（strain）：表示任何由一个独立分离单细胞繁殖而成纯种群体极其一切后代。一个微生物每一不一样起源纯培养物或纯分离物均可称为某菌种一个菌株。某一菌种内菌株数目几乎是无数。菌株名称可用字母加编号表示，字母多表示试验室、产地或特征等名称，编号则表示序号等数字。比如，BacillussubtilisAS1.398表示枯草芽孢杆菌蛋白酶生产菌株。“AS”为AcademiaSinica（中国科学院）缩写。又如，Bifidobacteriumbifidum

ATCC29521表示两歧双歧杆菌一个模式菌株。“ATCC”为AmericanTypeClutreCollection（美国经典菌种保藏中心）缩写。微生物分类与鉴定专题知识讲座第6页2024/4/187型(typeorform)：自然界存在差异较小同种微生物不一样类型，称为型。如结核分支杆菌依其寄主不一样可分为人型、牛型和禽型。(菌株同义词)群（group）：有些微生物特征介于两种微生物之间，我们把这两种微生物及其中间类型统称为一个群。(没有分类地位非正式地指定一组含有一些共同性状生物)如大肠菌群。相（phase）：自然界存在微生物交互变异一定阶段；态（state）：通常指微生物菌落变异状态。微生物分类与鉴定专题知识讲座第7页2024/4/188二、微生物命名1.学名（scientificname）按照《国际细菌命名法规》命名、国际学术界公认并通用正式名字。命名方法：国际法规命名，即林奈氏所创建双(三)名法。双名法规则：学名=属名+种名加词+（首次定名人）+现名定名人和鲜明定名年份由两个拉丁字或希腊字或拉丁化了其它文字组成，

属名（genericname）为名词,单数,开头字母大写，是该微生物主要特征。种名加词（specificepithet）

(adj.),首字小写,为形容词,是该微生物次要特征。

在出版物中用斜体，书写时在学名下划横线以表示斜体。微生物分类与鉴定专题知识讲座第8页2024/4/189例1．大肠埃希氏杆菌（简称大肠杆菌）：Escherichacoli

（Migula）CastellanietChalmers1919例2．枯草芽孢杆菌（简称枯草杆菌）:Bacillussubtilis

（Ehrenberg）Cohn

1872例3．金黄色葡萄球菌：Staphylococcusaureus

Rosenbach

1884

出现在分类学文件中学名，在此二者之后往往还加上3项内容，即首次定名人（正体字，用括号括住）、现名定名人(正体字)和现名定名年份，但普通情况下省去。微生物分类与鉴定专题知识讲座第9页2024/4/1810林奈氏双名法属名

十

种名加词十（首次命名人）＋现命名人十首次命名年份拉丁字或希腊字或拉丁化了其它文字组成首字母大写首字母不大写名词形容词主要特征次要特征斜体斜体(正体)正体正体如Aspergillusniger

曲霉黑色黑曲霉

Streptococcus

链条球状菌链球菌在出版物中用斜体，书写时在学名下划横线以表示斜体。微生物分类与鉴定专题知识讲座第10页2024/4/1811林奈氏三名法:当某种微生物是一个亚种或变种时，学名就应按三名法拼写，即在双名法学名后加写subsp或var（排正体，用括号括住，可省略），再加亚种或变种加词（排斜体，不可省略）。例1苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种（或称蜡螟苏云金芽孢杆菌）：Bacillusthuringiensis(subsp)galleria例2酿酒酵母椭圆变种（椭圆酿酒酵母）：Saccharomycescerevisiae(var)ellipsoideus微生物分类与鉴定专题知识讲座第11页2024/4/1812当前后两个或多个学名连在一起时，若它们属名相同，则相连一个或几个属名可缩写成一个、两个或三个字母，并在其后加上一个点。比如，Bacillus(芽孢杆菌属)可缩写成“B.”或“Bac.”。在实际工作中，当菌种最终判定还未结束，此时其学名中种名加词能够先用“sp”（正体，species单数缩写）或“spp”（正体，species复数缩写）来代替。比如，“Bacillussp.”可译为“一个芽孢杆菌”，而“Bacillusspp.”则可译为“若干种芽孢杆菌”或“一批芽孢杆菌”。微生物分类与鉴定专题知识讲座第12页2024/4/18132.

俗名（commonname）:

普通、通俗、地域性名字，含有简明和大众化优点，但往往涵义不够确切，易于重复，使用范围局限。如绿脓杆菌：铜绿假单孢菌Pseudomonasaeruginosa

白念菌：白色假丝酵母Candidaalbicans

金葡萄：金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus

微生物分类与鉴定专题知识讲座第13页2024/4/1814三、微生物分类依据1.经典分类判定依据：形态特征：个体形态（形状、大小、染色反应等）、群体形态（菌落特征、在半固体或液体中培养特点等）;生理生化特征：酶、代谢产物(种类、产量、显色反应等)、营养要求(能源、碳源、氮源和生长因子等)、细胞壁成份等测定生态特征：微生物间各种相互关系利用,生长温度、对氧要求、宿主种类等；遗传特征：DNA同源性分析G+C含量(mol%值)生活史特点；血清学反应；phage敏感性；其它：全细胞蛋白分析、多位点酶分析等微生物分类与鉴定专题知识讲座第14页2024/4/1815生理生化反应特征:1)、利用营养物质能力：包含对各种碳源、氮源利用能力，能量起源，对生长因子种类和数量要求等。2)、代谢产物种类和特征：主要测定微生物在生长过程中产生某类特殊生成物。比如在细菌判定时常测定被检测菌是否产生H2S、吲哚、醇、有机酸，能否还原硝酸盐能否使牛奶凝固、胨化等等。由此产生生化试验主要有：糖发酵试验、甲基红试验(methylredtest,简称M．R试验）、乙酰甲基甲醇试验(V．P试验）、靛基质试验（吲哚试验）、硫化氢试验、硝酸盐还原试验、过氧化氢酶试验和氰化钾生化试验等。微生物分类与鉴定专题知识讲座第15页2024/4/18162.当代分类依据：进化测量指征：20世纪70年代以前，讨论进化主要包括高等生物，相关微生物进化极少提及。进化指征选择:①形态学特征：微生物可利用形态特征少;形态特征在不一样类群中进化速度差异大，不准确。②分析和比较生物大分子结构特征。以蛋白质、DNA、RNA作为主要指征。微生物分类与鉴定专题知识讲座第16页2024/4/1817③微生物遗传型判定：

A：DNA碱基百分比测定——主要是（G+C）mol%值

B：核酸分子杂交——DNA-DNA和DNA-RNA杂交

C：16SrRNA寡核苷酸编目分析

D：氨基酸序列和蛋白质分析

F：遗传重组真核生物以能否进行有性生殖定义物种。原核生物发生转化、转导、结合物种间存在广泛染色体同源性。微生物分类与鉴定专题知识讲座第17页2024/4/1818④细胞化学成份判定：

A：细胞壁化学组成

B：全细胞水解液糖型：

C：磷酸类脂成份分析:D：枝菌酸分析：

E：醌类分析：

F：气相色谱技术应用：⑤当代分子生物学和免疫学技术采取DNA探针、PCR、DNA芯片、酶联免疫吸附测定（ELISA）免疫荧光技术：放射免疫技术;全自动免疫诊疗系统微生物分类与鉴定专题知识讲座第18页2024/4/1819

核酸探针技术原理：两条不一样起源核酸链假如含有互补碱基序列，就能够特异性结合而成为分子杂交链。据此，将己知核苷酸序列DNA片段用同位素或其它方法标识，加入己变性被检DNA样品中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列DNA区段形成杂交双链，从而到达判定样品中DNA目标，这种能认识到特异性核苷酸序列有标识单链叫DNA分子核酸探针或基因探针。制备核酸探针要注意两个关键性问题：要选择特异性强而又无交叉反应核酸(DNA或RNA)片段，可经过核酸重组和克隆以及人工合成、PCR扩增等技术取得；其次是标识物，当前惯用同位素(32P、125I、35S等）、光生物素及地高辛(digoxigenin)标识。微生物分类与鉴定专题知识讲座第19页2024/4/1820

核酸探针技术已被用于检验食品中一些常见病原菌。如产肠毒素性大肠杆菌（ETEC)是引发人和动物腹泻主要病原之一，在常规食品大肠杆菌检测时，产耐热肠毒素(ST)大肠杆菌惯用乳鼠试验来判定，该方法操作复杂、耗时多，不适于进行大样本检测，而且所用增菌方法还经常造成质粒相关毒力丧失。核酸探针技术特异、敏感而又没有放射性，且因不需要进行复杂增菌和取得纯培养而节约了时间，降低了由质粒决定毒力丧失机会，从而提升了检测准确性。另外在沙门氏菌检测中，核酸探针技术也已被广泛使用。微生物分类与鉴定专题知识讲座第20页2024/4/1821

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，又称为无细胞克隆系统，是1985年由Mullis创建一项DNA体外扩增技术。

PCR全过程由变性（denature）、退火（annealing）和延伸（extension）三步组成若干个循环，每步之间经过温度改变来实现转换。其基本原理是在体外对一特定双链DNA片段（或称靶DNA)进行高效扩增。首先将靶DNA双链加热变性为单链，然后加入两段人工合成与靶DNA两端邻近序列互补寡核苷酸片段作为引物(primer)，即左端引物和右端引物，该对引物与互补DNA单链碱基互补结合后，在有DNA多聚酶和四种dNTPs底物存在情况下，引物沿模板DNA链（靶DNA单链）按5’→3’方向延伸，自动合成新DNA双链。新合成DNA双链又可作为扩增模板，继续重复以上DNA多聚酶链反应。在扩增早期，靶DNA分子呈几何级数2n(n为循环次数）增加，伴随循环次数增多、模板DNA不停增加以及酶分子逐步消耗，扩增效率则下降，DNA分子呈线性（1+x）n（x为DNA分子实际增加率）增加，经过25-35次循环，可将靶DNA序列扩增100万～200万拷贝。微生物分类与鉴定专题知识讲座第21页2024/4/1822

PCR技术有快速、特异、敏感等特点，因而该技术在食品中致病菌检测方面含有很大应用潜力。如对食品中单核细胞增多症李氏杆菌检测，过去一直缺乏简单快速分离判定技术，克隆培养标准方法往往需要3-4周时间才能得出结果；免疫学技术（如ELISA等）检测时也存在着特异性、敏感性差等问题。采取PCR技术对食品中李氏杆菌溶血O-基因进行扩增，结果可在12h内完成整个检测过程，且样品中只需要含有5～50个细菌即可被检出。又如PCR技术能快速地检出肉食品中沙门氏菌，检测敏感性和特异性均为100%，确保了检测准确性。PCR还可用于各种病原微生物同时检测或判定，它是在同一PCR反应管中同时加上各种病原微生物特异性引物，进行PCR扩增。可用于同时检测各种病原体或判定出是那一型病原体感染。微生物分类与鉴定专题知识讲座第22页2024/4/1823基因芯片（genechip）又称DNA微阵列（DNAmicroarray），是指将许多特定寡居核苷酸片断或基因片段作为探针，有规律排列固定于支持物上形成DNA分子阵列。芯片与待测荧光标识样品基因按碱基配对原理进行杂交后，在经过激光共聚焦荧光监测系统等对其表面进行扫描即可获取样品分子数量和序列信息。它主要是基于近年来一个全新DNA测序方法之一杂交测序法应运而生。因为该技术同时将大量探针固定于支持物上，所以能够一次性对大量序列进行检测和基因分析，处理了传统核酸印迹杂交（southernblot和northernblot等）操作复杂，操作序列数量少等缺点。基因芯片技术突出特点在于其高度并行性、多样化、微型化和自动化，以及灵敏、高效和低成本等优点。微生物分类与鉴定专题知识讲座第23页2024/4/1824免疫荧光技术微生物分类与鉴定专题知识讲座第24页2024/4/1825酶联免疫吸附测定微生物分类与鉴定专题知识讲座第25页2024/4/1826四、分类方法1.经典分类法：采取双歧法整理试验结果2.数值分类法：测定100项以上各种性状，利用计算机进行菌株相互比较，并得出总相同值。普通认为同种微生物菌株之间相同值≧80%。3.遗传分类法：DNA杂交;G+C含量测定[DNA分子中鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占摩尔百分比值,即（G+C）mol%=（G+C/A+T+G+C)×100%]（热变性法、浮力密度法等）。微生物分类与鉴定专题知识讲座第26页2024/4/1827

分类学上当前主要采取较为间接比较方法——核酸分子杂交，来比较不一样微生物DNA碱基排列次序相同性进行微生物分类判定。核酸杂交详细测定方法很多，按杂交反应环境可分为液相杂交和固相杂交两大类。经典方法是固相滤膜法，它需要放射性同位素。当前最惯用方法则是复性速率法，它不需要放射性同位素，操作简便，并有很好重复性。经过核酸杂交技术能够明确界定细菌种，1987年国际系统细菌委员会要求，DNA相关性在70%以上，杂交分子热解链温度相差小于5℃作为种界限。另外对于新菌种或表型性状差异很小而难以必定菌株做出较可靠判定，并能够修正其它方法分类和判定错误。比如，在沙门氏菌属，在利用了核酸杂交方法后，改变了该属原来一个血清型一个种分类情况。微生物分类与鉴定专题知识讲座第27页2024/4/1828

G+Cmol%DNA分子含有四种碱基：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）。双链DNA碱基配对规律是：A-T和C-G，然而不一样有机体（G+C）：（A+T）摩尔百分比却各不相同，但不一样有机体G+Cmol%都有较稳定值。该值含义为：（G+C）/（G+C+A+T）×100%。当前，即使还没有一个统一界定各级分类单元G+C含量标准，但大量数据表明：同一个种内不一样菌株G+Cmol%差异应在4%～5%以下，同属不一样种G+Cmol%差异应在10%～15%以下。所以G+Cmol%测定已成为微生物分类判定工作一个主要部分。测定G+Cmol%方法很多，惯用有热变性温度法、浮力密度法和高效液相色谱法。在细菌分类中，因为热变性温度法操作简单、重复性好而最为惯用。微生物分类与鉴定专题知识讲座第28页2024/4/1829G+C含量测定

DNA分子中鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占摩尔百分比值,即（G+C）mol%=（G+C/A+T+G+C)×100%

（热变性法、浮力密度法等）微生物分类与鉴定专题知识讲座第29页2024/4/1830数值分类法即统计分类法，在200年前M.Adanson（1727-1806，法国植物学家）发表分类原理基础上结合当代计算机技术发展而来。主要观点：在一个分类群中，其所含信息量越大，即分类所依据性状越多，其分类效果也越好；次序建立自然分类单元时，每个性状都是等权；任何两分类实体间整体相同性，都是由每一正确相同性计算而来；能够由类群间相同性差异识别不一样分类实体；假如给予相关进化路径和机制一些假定，能够从组群分类学结构或从性状相关上作出种系发生推论；分类学应作为一门经验科学来对待和实践；数值分类学是以表象相同性为基础。微生物分类与鉴定专题知识讲座第30页2024/4/1831数值分类基本步骤计算两菌株间相同系数

Ssm= SJ=列出相同度矩阵将矩阵图转换成树状图a+da+b+c+daa+b+c微生物分类与鉴定专题知识讲座第31页2024/4/1832微生物分类与鉴定专题知识讲座第32页2024/4/1833五、微生物判定1.主要步骤：纯化、测定一系列必要指标、查找权威性判定手册2.判定技术不一样水平：细胞形态和习性：形态特征、运动、酶反应、营养要求及生长条件等细胞组分水平：细胞壁成份、氨基酸库、脂类、醌类、光合色素等分析蛋白质水平：氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应等基因或DNA水平：核酸分子杂交(DNA探针.PCR)、（G+C）mol%、转化和转导、16SrRNA寡核苷酸族分分析、DNA或RNA核苷酸序列分析等微生物分类与鉴定专题知识讲座第33页2024/4/1834

16SrRNA特点：

WoeseC.R之所以于1997年选择细菌核糖体小亚基16SrRNA核苷酸序列作为研究原核生物系统发育工具，是因其具备以下特点:

①16SrRNA存在于全部生物中并执行相同功效—合成蛋白质。②进化相对保守，分子序列改变迟缓，能跨越整个生命进化过程—含有生物分子计时器特点，素有细菌“活化石”之称。③分子中含有进化带度不一样区域，可用于进化程度不一样生物之间系统发育研究。④16SrRNA非常适合作为硕士物进化和系统发育工具。⑤微生物16SrRNA可从样品中直接提取，分析、比较其序列，进而确定其家族树中位置，克服了传统微生物学只能研究“可培养”微生物。(许多古细菌当前还不能人工培养，也是依据这种方法分类。)微生物分类与鉴定专题知识讲座第34页2024/4/1835

细

菌

域

Domainbacteria

古（生）菌域

Domainarchaea

真

核

生

物

域

Domaineukaryota

紫色细菌

线粒体

甲烷球菌属

甲烷杆菌属

真菌

植物

叶绿体

革兰氏阳性细菌

甲烷八叠球菌属

极端嗜盐菌

动物

蓝细菌

无硫绿细菌

热球菌属

伪变形虫

纤毛虫

黄杆菌

栖热胞菌属

热网菌属

热变形细菌

粘菌

鞭毛虫

产液菌属

微孢子

毛滴虫

双滴虫（假滴虫属）

--------------

生物总系统发育树（依据16SrRNA序列比较绘制，引自《布氏微生物学》）微生物分类与鉴定专题知识讲座第35页2024/4/1836

微生物快速判定和自动化分析技术1.微量生化系统检测如商品化API系统(API-20)、Enterotube等判定系统。

2.快速、自动化微生物检测仪器和设备:

阻抗测定仪、放射测量仪、微量量热计、生物发光测定仪、药敏测定仪、自动微生物检测仪。微生物分类与鉴定专题知识讲座第36页2024/4/1837API系统(AnalytabProductsInc)酶作用物和指示剂(用蒸馏水制备)(塑料板上有20个小杯,于35℃20、24h取出观察颜色,据厂方提供图表判定菌株属种。)API20E用于肠道菌检验;API20A判定厌氧菌;API20C判定酵母菌;APIzym判定链球菌放线菌和胨球菌等。API50判定API20E不能判定菌株。微生物分类与鉴定专题知识讲座第37页2024/4/1838微生物分类与鉴定专题知识讲座第38页2024/4/1839Enterotube系统分别装有不一样酶作用物和指示剂该装置可做以下15种试验：葡萄糖产酸产气，赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶，硫化氢，靛基质，乳糖和卫矛醇发酵，苯丙氨酸脱氨酶，尿素酶和柠檬酸盐,侧金盏花醇、阿拉伯糖、山梨醇和V.P试验等试验。查阅专门设计结果判定表。微生物分类与鉴定专题知识讲座第39页2024/4/1840微生物分类与鉴定专题知识讲座第40页2024/4/1841六、微生物惯用分类系统细菌：《伯杰氏细菌判定手册》（第八、第九版）、《伯杰氏系统细菌学手册》（第一版）。普雷沃（法）“细菌分类”。放线菌：中国科学院微生物研究所编著放线菌目分科、分属检索表。克拉西里尼可夫（前苏联）“细菌放线菌分类手册”。瓦克斯曼（美）“放线菌分类”。真菌：Smith、Alexopoulos、Ainsworth分类系统微生物分类与鉴定专题知识讲座第41页2024/4/1842

伯杰氏细菌分类系统

《伯杰氏细菌判定手册》是细菌分类系统综合和标准，由美国细菌学家协会（现称美国微生物学会）发起编写，最初指定DavidH.Bergey作为编委会主席，在1923年出版了手册第一版，相继在1925、1930、1934、1939、1948、1957、1994年出版了第二至第九版，成为国际上细菌学家普遍接收和采取。微生物分类与鉴定专题知识讲座第42页2024/4/18431994年出版《伯杰氏细菌判定手册》第九版几乎是《伯杰氏系统细菌学手册》缩写本，除了对细菌各属关键表观特征描述外，属内种判定特征以表格形式出现。对于判定工作十分方便。判定手册包含35群细菌。微生物分类与鉴定专题知识讲座第43页2024/4/18441984-1989年陆续出版四卷册《伯杰氏系统细菌学手册》第一版，在着重于表观特征描述基础上，结合化学分类、数值分类尤其是DNA相关性分析，及16SrRNA寡核苷酸编目在生物种群间亲缘关系研究中应用作了详细阐述，表达了细菌分类研究从表观向系统发育体系发展。除此，还附有每个菌群生态、分离、保藏及判定方法。微生物分类与鉴定专题知识讲座第44页2024/4/1845原核生物多相分类

多相分类（poly