噬菌体及其研究进展专家讲座

Contents噬菌体介绍1噬菌体应用技术介绍2噬菌体在食品产业中应用3前景及展望4噬菌体及其研究进展专家讲座第1页1、噬菌体介绍概念：噬菌体是感染细菌、真菌、螺旋体、支原体、立克次体及放线菌等微生物病毒,属非细胞微生物。特征：个体微小，需用电镜观察，能够经过细菌滤器；没有完整细胞结构，由核酸和蛋白质组成；专性活细胞内寄生,含有严格寄生特异性。噬菌体及其研究进展专家讲座第2页形态与结构形态：蝌蚪形，微球形，细杆形噬菌体及其研究进展专家讲座第3页噬菌体颗粒在结构上有很大差异，普通可分成三种类型，即

无尾部结构二十面体，有尾部结构二十面体和线状体，迄今已知噬菌体大多数是有尾部结构二十面体。

头部尾部噬菌体及其研究进展专家讲座第4页核酸：DNA或RNA,基因组大小为2-200kb，一些噬菌体基因组中还含有异常碱基。

大多数为线状双链

DNA噬菌体少数为环状单链多数为线状单链RNA噬菌体少数为线状双链噬菌体及其研究进展专家讲座第5页噬菌体及其研究进展专家讲座第6页化学组成核酸：DNA或RNA,基因组大小为2-200kb，一些噬菌体基因组中还含有异常碱基。

大多数为线状双链

DNA噬菌体少数为环状单链多数为线状单链

RNA噬菌体少数为线状双链噬菌体及其研究进展专家讲座第7页噬菌体及其研究进展专家讲座第8页按与宿主相互关系，噬菌体能够分为两种类型：

烈性噬菌体，温和噬菌体（溶原性噬菌体）

烈性噬菌体:能在宿主菌内复制增殖，产生许多子代噬菌体，并最终裂解细菌。

温和噬菌体（溶原性噬菌体）：噬菌体基因组整合于宿主菌染色体中，不产生子代噬菌体，也不引发细菌裂解，但噬菌体DNA随细菌基因组复制而复制，并随细菌分裂而分配至子代细菌基因组中。噬菌体及其研究进展专家讲座第9页吸附穿入生物合成装配释放烈性噬菌体溶菌周期噬菌体及其研究进展专家讲座第10页2、噬菌体应用技术应用判定细菌分型测定辐射剂量检测基因产物活性筛选目标基因

检测病原菌预防和治疗传染性疾病噬菌体及其研究进展专家讲座第11页3、噬菌体在食品产业中应用食源性疾病病原检测技术作为食品添加剂噬菌体展示技术检测真菌毒素噬菌体及其研究进展专家讲座第12页3.1食源性疾病病原检测技术

食源性疾病病原检测技术是食源性疾病预防与控制关健技术步骤。数据显示，每年大约有7600万人因食用了受污染食物而患病，其中91%是因为细菌污染造成。现存检测方法包含传统细菌分离培养法、多聚酶链式反应(PCR)法、生物芯片技术和免疫学方法等。缺点：费时费劲、价格昂贵、特异性或灵敏度低、国内试剂供给不配套等，极难适应公共卫生事件应急处理快速反应需要。有必要寻找一个简捷、快速、灵敏度高检测食源性病原微生物方法以及技术平台。噬菌体及其研究进展专家讲座第13页检测方法汇报基因检测

荧光染料标识

噬菌斑检测

噬菌体及其研究进展专家讲座第14页3.1.1噬菌斑检测原理：用噬菌体截获某种病原菌，随即病原菌被噬菌体感染，用杀毒剂将胞外剩下噬菌体杀死，然后将噬菌体与被感染细胞混合并在装有软琼脂双层培养基上培养，被感染细胞破裂释放出子代噬菌休，在培养基中就会形成空斑。噬菌体及其研究进展专家讲座第15页试验方法标本采集后置于SC增菌管中37℃增菌18h左右,SS平板分离培养37℃过夜,然后挑出含有沙门氏菌特征单个菌落划线接种于普通琼脂平皿上,每块平板划格后可接种8个菌落左右。在每格中央用灭菌毛细滴管滴上O-I噬菌体,待溶液干后置37℃6-8h培养或过夜,观察噬菌体裂解情况。发觉被O-I噬菌体裂解菌株,马上挑取噬斑周围菌苔直接做沙门氏菌A-F多价血清凝集试验,凝集阳性者即可初步汇报结果,然后转种克氏双糖铁管作深入判定分型。噬菌体及其研究进展专家讲座第16页简例O-I噬菌体是作用于沙门氏菌属特异性噬菌体,染色体为双链DNA,受体是宿主细胞壁上关键多糖乙酰氨基葡萄糖。应用O-I噬菌体进行饮食行业及公共场所从业人员带菌调查结果表明,沙门氏菌检出率为0.131%,与广东省报道0.134%检出率相近,说明O-I噬菌体应用对沙门氏菌诊疗含有较高特异性和敏感性,不失为大量从业人员沙门氏菌调查较为理想快速诊疗方法。噬菌体及其研究进展专家讲座第17页3.1.2荧光染料标识法原理：选取一个适当染色剂，噬菌体核酸染色标识，然后用标识过噬菌体侵染对应宿主菌，噬菌体吸附在宿主菌表面后，随即将标识过核酸注入宿主细胞，伴随越来越多噬菌体核酸注入，细胞内荧光伴随荧光素增多而增强，借助荧光显微镜便能判定宿主菌存在，从而实现病原菌检测。噬菌体及其研究进展专家讲座第18页介绍A图只有细菌,荧光视野里不见任何发光物质;B图中只有荧光标识O-I噬菌体,视野下偶然可见少许圆点状荧光物质,不见菌形;C图是荧光标识O-I噬菌体和沙门氏菌混合,可见大量杆状物,少许点状物,极少数彗星状杆状物,将杆状物质与沙门氏菌革兰氏染色形态进行比较,二者一致。由此可推知,C图中杆形物是侵有荧光噬菌体沙门氏菌,点状物是标识O-I噬菌体,结合B图可知彗星状杆形物是即将裂解宿主菌。噬菌体及其研究进展专家讲座第19页简例蒋鲁岩等用此方法快速检测食品源沙门氏菌，检测灵敏度达10CFU/100μL;120份食品样品中沙门氏菌O-I噬菌体检测与生化判定结果阳性率分别为9.17%和10%,符合率为91.7%。表明用荧光标识O-I噬菌体能够快速、直观、准确、大量地检测食品中沙门氏菌。噬菌体及其研究进展专家讲座第20页3.1.3汇报基因检测技术该技术中，将一个汇报基因经过噬菌体插入到目标菌体DNA中，伴随汇报基因表示，目标菌体便可快速得到检测。应用在这一技术汇报系统主要有原核生物和真核生物荧光素酶(lux,luc)基因，细菌冰核蛋白(inaW)基因，E.coliβ-半乳糖苷酶(lacZ)基因和生物素亲和蛋白。汇报噬菌体已经能够成功检测许多菌种，如E.coli,Salmonella.spp等。噬菌体及其研究进展专家讲座第21页介绍噬菌体及其研究进展专家讲座第22页利用荧光素酶基因作为汇报基因快速检测技术对于细菌来说，发光机理可用下式表述：FMNH2+RCHO+O2→FMN+H2O+RCOOH+hν(490nm)反应是在荧光素酶催化下进行。细菌荧光素酶是一个77kD二聚体，其中包含α亚基(4037kD)和β亚基(37kD)。当前，生物发光基因(lux,luc)在汇报噬菌体检测技术中应用最为广泛。Waddell等利用转座子致突变，将lucA和lucB基因插入到E.coliO157:H7温和噬菌体φV10中，构建了一个荧光素酶转座噬菌体，这一噬菌体能够使E.coliO157:H7在1h内被成功检测，并汇报出结果。Masahito等将绿荧光蛋白(GFP)基因分别插入到T偶数型噬菌体PP01外壳蛋白(SOC)基因C末端和N末端，构建成噬菌体PP01-GFP/SOC和PP01-SOC/GFP，这种对E.coliO157:H7特异噬菌体能够成功检测菌体可培养细胞，不可培养但可存活细胞(VBNC)及经过巴氏消毒过细胞，灵敏度高，检测时间仅为20min。噬菌体及其研究进展专家讲座第23页以β-半乳糖苷酶作为汇报基因快速检测技术β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)是一个催化β-半乳糖苷水解反应糖苷酶。β-半乳糖苷酶作用特征是伴随水解反应底物不一样而改变，邻硝基苯β-D-半乳糖苷是检测中惯用灵敏基质，它被β-半乳糖苷酶水解后产生蓝色沉淀，该技术能够使检测灵敏度到达生物发光荧光素酶检测水平。Goodridge等设计了一个带有lacZ基因T4噬菌体，用这种噬菌体感染待测样品，并用化学发光基质作为检测基质，研究人员成功检测了肉汤培养基中E.coli，检测限仅为102CFU/ml。然后，研究人员将最大约率数(mostprobablenumber，MPN)法应用到食源性病原菌检测中，检测水平可降至10CFU/ml，用时仅1h。噬菌体及其研究进展专家讲座第24页3、噬菌体在食品产业中应用食源性疾病病原检测技术作为食品添加剂噬菌体展示技术检测真菌毒素噬菌体及其研究进展专家讲座第25页3.2作为食品添加剂美国食品和药品管理局同意了一个由噬菌体病毒混合而成产品，主要用于杀灭肉制品中李氏杆菌。这是美国首次同意将病毒用作食品添加剂。美药管局教授称，该产品在制备过程中可能留有残毒，但试验表明，这些微量残毒不会引发任何健康问题。该产品包含6种噬菌体病毒，可在熟肉片和香肠等包装前喷洒在这些肉制品上，有效杀灭各种李氏杆菌，预防由这些细菌引发食物中毒。产品中所包含噬菌体只会攻击李氏杆菌，对人体和植物细胞都不会产生影响。

噬菌体及其研究进展专家讲座第26页3、噬菌体在食品产业中应用食源性疾病病原检测技术作为食品添加剂噬菌体展示技术检测真菌毒素噬菌体及其研究进展专家讲座第27页3.3噬菌体展示技术检测真菌毒素噬菌体展示技术(Phagedisplaytechnology)是20世纪80年代逐步建立并发展起来一项分子生物学新技术。它以噬菌体或噬粒为载体,使外源肽或蛋白基因与噬菌体表面特定蛋白基因在其表面进行融合表示,进而经过亲和富集法筛选表示有特异肽或蛋白质噬菌体。噬菌体及其研究进展专家讲座第28页真菌毒素作为天然毒素广泛存在于谷物等食品中，世界很多国家都有被污染汇报，因为真菌毒素属于痕量污染物，所以检测技术主要有各类色谱法和利用抗体免疫学方法。其中高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱和质谱联用（GC-MS）优点：灵敏度和可靠性都很高缺点：样品处理繁琐，仪器昂贵，现场快速检测中难以普及使用酶联免疫吸附检测技术(ELISA)优点：能够同时大批量检测样品，携带方便，操作简便和经济,常以试剂盒形式出现且易商品化缺点:当前用于ELISA检测试剂盒各类毒素单克隆抗体(McAb)主要起源于小鼠杂交瘤细胞，在筛选单克隆抗体生产杂交瘤细胞株系上，需要做杂交融合，亚克隆筛选，是一个长久复杂过程，既花费财力、物力，又浪费时间，且检测所用真菌毒素标准品价格昂贵。噬菌体及其研究进展专家讲座第29页利用噬菌体展示技术制备抗体、模拟抗原表位，不但绕过了细胞融合，而且能够以单克隆抗体（McAb）或单链抗体（ScFv）为靶分子筛选真菌毒素模拟抗原表位，代替真菌毒素标准品，建立无毒ELISA检测方法，确保试验操作人员和相关研究人员人身安全。熊啸（年）等选取抗黄曲霉毒素M1（anti-AFM1,AflatoxinM1,AFM1）单克隆抗体为筛选配基，从噬菌体表面展示随机7肽库中筛选出AFM1抗原模拟表位LTSFPRH和MAPSSWR，为研制出安全无毒ELISA试剂盒奠定基础。噬菌体及其研究进展专家讲座第30页4、前景及展望噬菌体检测技术含