生物药物的提取纯化技术专家讲座

第七章

生物药品提取纯化技术

第一节

概

述

第二节

预处理及固液分离技术

第三节

沉

淀

第四节

萃取(Extraction)第五节

吸附(Sorption)第六节

亲和层析第七节

新型层析分离纯化装置及介质

生物药物的提取纯化技术专家讲座第1页生物药品稳定性受pH、温度、离子强度、提取过程所使用溶剂和表面活性剂、金属离子等方面影响，生物药品对剪切力也很敏感，分子量越大，稳定性就越差。所以，在分离纯化过程中，条件应该越温和。许多生物药品组分浓度非常低，但生物药品产品纯度却要求很高，含量要到达95％甚至98％以上，最好是结晶态产品。另外，生物药品还应含有正常颜色、稳定性和溶解速率。第一节概述一. 生物药品特点生物药物的提取纯化技术专家讲座第2页生物药品提取和纯化可分为5个主要步骤：预处理、固液分离、浓缩、纯化和产品定型(干燥，制丸，挤压，造粒，制片)。每一步骤都可采取各种单元操作。在提取纯化过程中，要尽可能降低操作步骤，因为每一操作步骤都不可防止带来损失。生物药品提取工艺流程基本模式如图7-1所表示。二、提取纯化单元操作和基本工艺流程生物药物的提取纯化技术专家讲座第3页生物药物的提取纯化技术专家讲座第4页依据主要分离原因排列单元操作分离范围见表7-1。

生物药物的提取纯化技术专家讲座第5页分离纯化技术特点之一是各种技术相互交叉，新型分离纯化方法不停涌现。如沉淀技术和亲和技术相结合，形成了亲和沉淀技术；超滤和亲和技术相结合，形成了亲和超滤技术；萃取与载体膜相结合，形成了液膜载体萃取法。这些新方法取长补短，使分离纯化过程愈加科学合理、快速有效、经济实用。三、提取纯化单元操作技术特点生物药物的提取纯化技术专家讲座第6页生物药品提取纯化技术另一特点是重视新材料研制开发，如膜分离介质，层析介质，亲和配基，新型萃取剂等在最近几十年来发展非常快。提取纯化设备方面推陈出新，在设备计算机控制及生产自动化、连续化及GMP规范化等方面取得了很大成就。生物药物的提取纯化技术专家讲座第7页膜过滤技术发展很快，分为微滤、超滤和纳滤，不但用于细胞分离，还用于蛋白质浓缩。超滤技术主要特点是节能，对生物大分子类药品无破坏作用。液-液萃取广泛应用于抗生素及小分子量药品提取。溶剂选择余地大，且易实现大规模生产。高速离心式液体萃取机是当前效率最高，使用最广装置。液-液萃取技术还衍生出许多新萃取技术，如双水相萃取，亲和萃取，超临界萃取等。双水相萃取蛋白质类药品是大规模提取高纯度蛋白质类药品有效技术。而超临界萃取利用超临界流体物理特征，即经过压力和温度改变控制溶质在溶剂中分子扩散能力，控制溶质溶解度，从而实现分离。生物药物的提取纯化技术专家讲座第8页层析(色谱)技术是最近几十年来发展最快纯化技术。层析装置种类很多，且分离纯化机理也各不相同，适应于许多药品产品分离纯化。离子交换色谱是应用最广，且易于实现大规模生产方法。应用于抗生素、氨基酸、核苷酸、蛋白质提取和纯化。分子筛层析依据分子量大小不一样原理，适应于蛋白质类药品纯化。层析分离技术最高层次当属基于分子识别技术，如亲和层析。这一技术已衍生出一大批新技术，如免疫亲和层析、染料亲和层析、金属离子螯合层析。疏水性层析是基于分子疏水性能来分离纯化。生物药物的提取纯化技术专家讲座第9页高效液相色谱法本是分析化学惯用伎俩，现已将其扩展到生物药品分离纯化应用中。有些设备不但可进行分析，也可进行分离纯化，在新药开发过程中，缩短了分离纯化所需时间。与层析技术同时发展各种分离介质是层析分离技术保障，商品化预装柱、缓冲剂、计算机程序控制使操作变得简单易学。置换层析与洗脱层析不一样，是指吸附在层析柱上一个组分被另一个置换剂(与层析上介质亲和力大于原被吸附组分)置换出来层析技术。该技术有上样量高，分辨率高特点。被分离样品在分离过程中还有浓缩作用。总之，伴随科技发展，新分离、提取、纯化技术将不停得到改进。生物药物的提取纯化技术专家讲座第10页1994年开始了各项GMP验证，其中工艺论证是一个不可缺乏组成部分。产品纯化是生产过程中关键一步。这包括到药品质量。所谓工艺验证，就是经过系统方法得到关于生产工艺书面材料，证实并确保生产过程能一直如一地生产出特定高质量产品。提取纯化处理工艺验证范围包含：厂房设施、工程仪表、机械设备、生产环境、工艺条件、计算机软件、介质、原材料、半成品、成品、操作人员素质和测试方法等。四、提取纯化工艺论证生物药物的提取纯化技术专家讲座第11页以上各个部分都要有验证材料或试验数据，依据这些材料和数据写出验证汇报。当工艺某一部分有较大变动(大修、工艺条件改变)时，要进行重新验证（再验证）。再验证是针对某一部分行动，而不是整个工艺过程验证，所以比较简单、快速、易行。验证实施过程包含以下步骤：提出验证要求、组织验证小组、制订验证方案、实施验证试验、写出验证汇报和再验证。生物药物的提取纯化技术专家讲座第12页一些药品(如抗癌药)往往对生物活细胞含有毒性，所以必须对中试或大生产全过程设置屏蔽防护装置。其基本要求是：人员进出口要加以控制；在工作场所保持负压(一级、二级或三级生物密封室)；空气排放必须经过HEPA过滤器；对有烟雾产生设备要有附加屏蔽防护装置；有适当个人防护办法；生产过程中所排放废物要有生物学或化学除污方法；对工作人员进行医疗监测；环境监测。五、生物药品生产屏蔽防护技术(Containmenttechnology)生物药物的提取纯化技术专家讲座第13页生物药品纯化工艺技术要求高，应尽可能选取高质量设备，并要求有清洁各级GMP厂房。纯化方法设计应考虑到尽可能去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白、糖及其它杂质，要预防纯化过程中带入有害物质。六、纯化工艺过程质量控制生物药物的提取纯化技术专家讲座第14页关于纯度要求，可视产品起源、用途和使用方法而制订，比如经重复屡次使用真核细胞表示制品，要求纯度到达98％以上；屡次使用原核细胞表示制品要达95％以上；外用制品纯度可降低要求。生物药物的提取纯化技术专家讲座第15页纯化工艺每一步均应测定纯度，计算提纯倍数和收率等。纯化工艺过程中应尽可能防止加入对人体有害物质，若不得不加入，应设法除尽；并在最终产品中检测残留量，残留量应远远低于危害剂量，还要考虑到屡次使用积蓄作用。生物药物的提取纯化技术专家讲座第16页 指发酵液不经预处理，或仅经过简单预处理。可采取树脂吸附法、柱式流化床吸附法等。因为可无须先分离菌丝体和固形物，因而可简化分离过程，提升产品收率，降低吸附剂损耗，缩短操作时间。第二节预处理及固液分离技术一.直接从发酵液中提取产品生物药物的提取纯化技术专家讲座第17页(一)细胞破碎方法分类可分为两大类：机械破碎和非机械方法破碎。对液相物料，机械破碎法有超声波、机械搅拌和压力法。对固相物料，机械破碎法有研磨法和压力法。非机械破碎法分为脱水(空气干燥、真空干燥、冷冻干燥和有机溶剂干燥)和裂解(物理法、化学法和酶法)两类。裂解法又分为渗透压突变法、冷冻和解冻法等。化学法有阴阳离子洗涤剂处理法、抗生素处理法和甘氨酸处理法。酶法可用溶菌酶等相关酶制剂处理，或用噬菌体裂解、抗生素处理等。二.细胞破碎(Celldisruption)生物药物的提取纯化技术专家讲座第18页

高压均质器法：是当前较为理想大规模破碎细胞方法。可破碎酵母菌、大肠杆菌、假单胞菌、杆菌，甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就轻易破碎。高压均质器操作参数较简单，主要是操作压力、温度以及经过高压均质器次数。但机理却颇为复杂。(二)破碎技术(微生物细胞破碎)工业上所用高压均质器操作压力普通为55MPa，菌悬液一次经过均质器细胞破碎率在12％～67％。细胞破碎率与细胞种类相关。生物药物的提取纯化技术专家讲座第19页可分为离心过滤、离心沉降、离心分离3种类型，所使用设备有过滤式离心机、沉降式离心机和分离机。过滤式离心机可用于处理悬浮固体颗粒较大、固体含量较高场所。沉降式离心机用于分离固体浓度较低固液分离。分离机用于分离两种互不相溶、密度有微小差异乳浊液或含微量固体微粒乳浊液。三.离心生物药物的提取纯化技术专家讲座第20页离心技术在生物制药研究及生产中应用极广，如从培养液中分离搜集细胞，去除细胞碎片，搜集沉淀物，从含蛋白质液体中除去蛋白质吸附剂，也包含用超速离心法分离溶解大分子。生物药物的提取纯化技术专家讲座第21页膜分离基本原理是：膜作为一个有选择性障碍物，允许一些组分经过，而不许其它组分经过，所以将料液分成透过液和保留液两部分。膜分离技术在分离物质过程中不包括相变，无二次污染。可分批操作，也可连续操作，易于自动化和扩大生产规模，分离效率较高。膜分离缺点是膜易污染，使膜性能降低。合成材料制成膜在耐热、耐化学腐蚀等方面尚需改进，膜分离技术需要与其它分离技术结合起来使用。(一)膜分离原理及特点四、膜分离技术生物药物的提取纯化技术专家讲座第22页按照膜孔径大小，可将膜分为：微滤膜(0.025～14

m)；超滤膜(0.001～0.02m)；反渗透膜0.000l～0.001m)；纳米膜(平均直径2nm)。(二)膜分离材料及装置膜能够是完全可透，也能够是半透性；有膜是独立存在于流体间，也有膜是附着于支撑物或载体上微孔隙中。膜还必须含有高度渗透选择性。生物药物的提取纯化技术专家讲座第23页

用于生物制药工业中膜材料要求耐温性能要好、耐酸碱处理、有很好生物相容性（即要求膜对蛋白质和酶等生物大分子不产生变性，无抗原性）。

按照膜结构分为对称性膜、不对称膜和复合膜。生物药物的提取纯化技术专家讲座第24页

按照膜材料可分为合成聚合物膜、无机材料膜和不锈钢膜。如惯用微滤膜材料有醋酸纤维酯和硝酸纤维酯、再生纤维素和聚四氟乙烯等，超滤膜材料有聚砜、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、硝酸纤维酯(或醋酸纤维酯)、尼龙、丙烯腈-氯乙烯共聚物膜。另外还有不锈钢膜。生物药物的提取纯化技术专家讲座第25页(三)膜过滤操作主要膜分离过程以下表

生物药物的提取纯化技术专家讲座第26页微滤器、超滤器和反渗透器主要类型有平板式、管式、中空纤维式和螺旋卷绕式4种。生物药物的提取纯化技术专家讲座第27页当溶液中欲被分离蛋白质不受妨碍地经过超滤膜孔隙时，假如在膜一侧结合着亲和配基，该蛋白质就会与配基结合，因而结聚在膜这一侧。不与配基结合其它物质就将穿过孔而被带走。再用适宜洗脱剂将该蛋白质洗脱下来。(四)亲和超滤

1．原理生物药物的提取纯化技术专家讲座第28页

决定超滤亲和纯化效率及质量主要原因是：目标物代表性分子量、大分子配基及超滤膜截留分子产量。超滤膜孔径应适宜，并要求分布均匀，以预防漏出配基。要便于蛋白质及杂质自由经过。大分子配基吸附到膜上，会降低过滤速度，有配基还会沉淀到膜表面。在膜表面引入电荷能够预防这种情况发生。生物药物的提取纯化技术专家讲座第29页亲和配基和目标组分结合方式有两种：(1)将含有目标物溶液与配基在超滤器内混合，或单独在混合槽内混合：(2)将含有目标物溶液及含有配基溶液用泵分别送至膜两侧，当蛋白质经过膜抵达膜另一侧(配基所在地)时，与配基结合。第1种方法较为惯用，适应于相对较清发酵液，或发酵液预先经过预超滤。2．亲和结合方式生物药物的提取纯化技术专家讲座第30页蛋白质和酶粗制品脱盐方法除了离子交换法、凝胶过滤外，还有透析和渗滤。

五.渗滤(Diafiltration)技术和透析(Dialysis)生物药物的提取纯化技术专家讲座第31页

渗滤是利用超滤器，选择性地使低分子量溶质及水分子经过超滤膜，而保留分子量较大溶质。在操作过程中，要不停补充同体积去离子水，使原溶液中产品得到纯化。其特点是：原溶液体积保持恒定，目标物浓度也保持恒定。生物药物的提取纯化技术专家讲座第32页

超滤是在外压作用下进行，而透析是在常压下依靠小分子物质扩散运动来完成。透析装置有：透析袋、旋转透析器、平面透析器、连续透析器、浅流透析器、微管透析器。生物药物的提取纯化技术专家讲座第33页泡沫分离原理是：将气体通入含各种组分溶液中，因为这些组分表面活性有差异，所以在溶液表面，一些组分将形成泡沫，泡沫稳定性取决于操作条件及溶液生物学特征。泡沫中含有更多表面活性成份，故泡沫组分种类及其含量与溶液中不相同。这么，溶液中不一样组分就得以分离。六、泡沫分离生物药物的提取纯化技术专家讲座第34页生物药物的提取纯化技术专家讲座第35页在泡沫分离过程中，要选择好操作条件，以保持酶蛋白天然结构不变，活力不降低。

泡沫分离法特点是分离所用机械结构简单，可连续操作，轻易放大，费用也不高。

泡沫分离目标，首先提升酶蛋白富集率(泡沫中蛋白质浓度/最初溶液中蛋白质浓度)，另首先提升酶蛋白提取率(泡沫中蛋白质质量/最初蛋白质质量)，或使多组分混合物中某一组分分配系数最大。生物药物的提取纯化技术专家讲座第36页影响蛋白质沉淀原因有蛋白质溶解性、蛋白质及沉淀剂浓度、溶液pH、离子强度、温度和混合物中其它成份浓度。沉淀剂状态(固态或饱和溶液)，沉淀剂加入速度、混合时间及混合程度、沉淀物分离提取等原因也必须考虑。沉淀普通只能到达初步纯化目标。技术较为成熟，在大规模生产中广泛应用。

第三节沉淀一、沉淀生物药物的提取纯化技术专家讲座第37页去除沉淀经典操作是用洗涤法，利用溶解度差异将目标物与杂质分离。假如沉淀剂和目标物在溶解性相同，可考虑用超滤方法或层析方法将它们分离。惯用分离沉淀方法有：沉淀、悬浮法、离心法、过滤法或错流膜过滤。生物药物的提取纯化技术专家讲座第38页(二)盐析剂用量确实定

生产中所需硫酸铵饱和度，需经过试验决定。(一)盐析剂选择

惯用盐析剂包含硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠等。最惯用是硫酸铵。二.盐析生物药物的提取纯化技术专家讲座第39页pH值操作：从酶溶解度考虑，盐析操作pH值常选择在酶等电点附近。但从酶稳定性方面来考虑，有些酶在等电点时稳定性较差，所以要选择最正确pH值。普通要求在酶最稳定pH值前提下，再考虑最适宜于酶沉淀pH值。在操作时，一旦确定最正确pH值后，在添加硫酸铵之前，加入酸或碱，调整好酶液pH值，要尽可能防止pH值忽高忽低，以免破坏酶稳定性。在添加硫酸铵时，要注意搅拌，并注意硫酸铵加入速度。普通是由少到多，迟缓加入，硫酸铵尽可能磨成细粉。(三)盐析操作生物药物的提取纯化技术专家讲座第40页酶液静置：加完硫酸铵后，酶液要静置一段时间，使酶蛋白完全沉淀下来，酶静置后，就不要再搅拌。温度控制：有些酶在较高温度下稳定性能很好，可在常温下进行盐析操作，而对于大多数酶，尽可能在低温下进行盐析操作。生物药物的提取纯化技术专家讲座第41页用有机溶剂处理时，尽可能用稀有机溶剂沉淀，而且一定要在低温下进行，最好在0℃以下。用有机溶剂沉淀得到酶蛋白，不要放置过久，要尽快加水溶解。(一)有机溶剂选择可用于酶蛋白质沉淀有机溶剂包含醇类物质等。(二)有机溶剂沉淀操作三、有机溶剂沉淀生物药物的提取纯化技术专家讲座第42页许多食用级和药用级酶制剂，惯用酒精作为沉淀剂。酒精用量应依据试验来确定。沉淀宜在低温下进行，普通取15℃以下，但温度太低，会使滤液中溶解度较低蛋白质也沉淀下来。沉淀时pH值，尽可能靠近酶等电点附近。酒精是蛋白质变性剂，酒精浓度太高时，易引发变性。加酒精后，在酶沉淀之前，变性愈加厉害，所以酒精最好在沉淀还未发生之前加完。酒精不能一次性全部加完，应分批加入，加入时应不停搅拌。加入一定量高岭土或硅藻土，作为酶沉淀载体，便于离心搜集。离心分离结束后，应马上加水或缓冲液将酶沉淀物溶解，及时降低沉淀物内酒精浓度，以防酶变性。(三)影响酒精沉淀收率主要原因生物药物的提取纯化技术专家讲座第43页将配基与可溶性载体偶联后形成载体-配基复合物(亲和沉淀剂)，该复合物与生物分子结合，在一定条件下可沉淀出来(即经过诱导沉淀)。

(一)原理四、亲和沉淀(Affinityprecipitation)生物药物的提取纯化技术专家讲座第44页配基-载体复合物可选择性地与蛋白质结合。配基包含：酶基质、辅酶、免疫配基及有机染料等。溶液中pH、离子强度及蛋白质浓度等条件对亲和结合影响力并不大。只有竞争性配基会降低产物与原配基亲和结协力，甚至使亲和结合发生逆转。生物药物的提取纯化技术专家讲座第45页引导产生沉淀方法有：离子交联、加入带相反电荷聚合物、加入带相反电荷疏水基团、改变pH、诱导产生疏水性沉淀、温度诱导沉淀。

亲和沉淀收率取决于亲和反应效率，也取决于沉淀性能。亲和反应之后，假如沉淀效果不好，可加入一些天然多聚物促进沉淀。生物药物的提取纯化技术专家讲座第46页

亲和结合：将亲和配基加到含有目标物蛋白质溶液中，调整好相关沉淀条件，使之有利于亲和结合。(二)亲和沉淀操作生物药物的提取纯化技术专家讲座第47页

洗涤：假如是在未经处理粗制液中发生亲和沉淀，可能会发生一些非特异性结合，一些无关物质会陷于其中，所以在分离目标物之前，要洗涤沉淀。其做法是：加入适当清洗剂重新溶解沉淀，再沉淀；或在专一性洗脱之前，彻底洗涤沉淀。

生物药物的提取纯化技术专家讲座第48页

配基-载体复合物与目标蛋白质分离：分离结束之后，要确保回收目标物蛋白质和配基-载体复合物，目标蛋白质要到达一定纯度，收率要高，要重新利用配基-载体复合物。配基价格较为昂贵时，多加入些天然载体可使配基-载体复合物循环使用效率提升以降低配基损失。生物药物的提取纯化技术专家讲座第49页惯用沉淀技术还有用聚合物絮凝剂沉淀法、金属离子沉淀法、等电点沉淀法等。五、其它沉淀技术生物药物的提取纯化技术专家讲座第50页萃取指物质在两相之间传质过程。最常见是液液萃取，用有机溶剂作为萃取剂，萃取水溶液中某种组分。原溶剂和萃取剂普通是互不混溶。依据溶质在这两个互不混溶液相中分配系数差异，而实现将溶质浓缩到萃取剂中。萃取是经过溶质在两相之间竞争性溶解(分配)而实现。萃取多用于小分子生物药品，如抗生素和核苷酸，但也可萃取生物大分子，如双水相萃取技术萃取蛋白质。(一)定义和原理第四节萃取(Extraction)一、概述生物药物的提取纯化技术专家讲座第51页pH值影响分配系数，因而对萃取收率影响很大。影响萃取操作原因主要有：1．pH值二、萃取操作影响原因生物药物的提取纯化技术专家讲座第52页普通来说，低温萃取速度较慢，可适当提升温度；不过因为萃取剂多为有机溶剂，在高温下，产品稳定性较差而受破坏，故萃取尽可能在低温或常温下进行。温度还影响分配系数。2．温度生物药物的提取纯化技术专家讲座第53页加入盐析剂，可使溶质水中溶解度降低而易于转入到溶剂中去。盐析剂加入，也能降低有机溶剂在水中溶解度。3．盐析生物药物的提取纯化技术专家讲座第54页萃取剂选择依据主要是对所要萃取组分有较大溶解度，还应含有良好选择性。三、溶剂选择选择性可用分离因数来表示。依据相同相溶原理，应选择与目标物结构相近溶剂。在工业上还要求价格低廉，挥发性小，毒性小，起源广等特点。另外，还要考虑对产品选择性能，与原溶剂相不相混溶，两相有较大密度差，产品对萃取剂敏感程度，萃取剂应易于回收。生物药物的提取纯化技术专家讲座第55页在萃取时要尽可能防止乳浊液形成。可经过过滤和离心分散法、加热、稀释、加电解质、吸附、顶替、转型等方法破坏乳浊液。在生产中，应尽可能防止采取强毒性溶剂，惯用溶剂有乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲醇、丁醇。生物药物的提取纯化技术专家讲座第56页

萃取操作流程分单级萃取和多级萃取。多级萃取中又有多级错流萃取和多级逆流萃取。工业上萃取操作包含3个步骤：①混合：料液和萃取剂充分混合，形成含有很大比表面积乳浊液产物，自料液转入萃取剂中；②分离：将乳浊液分成萃取相和萃余相；③提取及回收：产品提取及回收萃取剂，有时也要从萃余相中回收萃取剂。四、萃取方式生物药物的提取纯化技术专家讲座第57页双水相系统普通是指将两种亲水性聚合物都加在水溶液中，当超出某一浓度时，就会产生两相，两种聚合物分别溶于互不相溶两相中。经典两相系统如表7-11所表示。(一)双水相形成双水相萃取法一个主要优点是可直接从细胞破碎匀浆中萃取蛋白质，而无需分离细胞碎片。因而可直接萃取，到达固液分离和纯化目标。五、双水相萃取生物药物的提取纯化技术专家讲座第58页生物药物的提取纯化技术专家讲座第59页影响物质分配平衡主要原因有：聚合物及成盐浓度，聚合物平均相对分子质量，体系pH值及其它盐种类及浓度，菌体或细胞种类及含量，体系温度等。(二)影响物质分配平衡原因生物药物的提取纯化技术专家讲座第60页将一些小分子配基共价连接到形成相多聚物之上，在双水相系统中，配基如聚集于上层，目标物蛋白质就经过形成生物特异性复合物而转移到上层，从而到达纯化该种蛋白质目标。(三)双水相亲和分配纯化生物分子生物药物的提取纯化技术专家讲座第61页亲和分配双水相萃取技术可用于酶及蛋白质分离纯化，还可分离一些特定细胞。

许多配基都可用于亲和分配，包含酶、抗原及抗体、激素及其相对应接收体等。惯用聚合物有聚乙二醇、葡聚糖和变性淀粉等，其中使用最多是聚乙二醇。生物药物的提取纯化技术专家讲座第62页反胶束是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成纳米尺度一个聚集体。反胶束溶液是透明、热力学稳定系统。六、反胶束提取纯化技术生物药物的提取纯化技术专家讲座第63页

影响反胶束萃取蛋白质主要原因有：水相pH值、离子强度、温度、亲和表面活性剂。

反胶束系统作为液液萃取方法，更含有选择性。这种方法优点是使热敏性、亲水蛋白质在一个近似于水相环境中提取出来，使蛋白质活性不受到损失。在反胶束萃取蛋白质研究中，惯用是阴离子表面活性剂。生物药物的提取纯化技术专家讲座第64页超临界流体萃取技术优点是节能，可使用生理惰性溶剂在低温下分离组分，当前这一新技术应用即使还不普遍，但潜在应用前景很广。七、超临界萃取技术生物药物的提取纯化技术专家讲座第65页广义吸附是有选择性地将一个或各种溶质从流动相中转移到固定相中过程。利用固定相和流动相之间相互作用将组分分离开来。吸附机理可分为5类：分子大小、范德华力、极性、离子交换、亲和。在此主要介绍层析、吸附(Adsorption)和离子交换技术。第五节吸附(Sorption)生物药物的提取纯化技术专家讲座第66页

层析也称为色谱，利用各组分与固定相亲和力或相互作用方面差异实现分离。层析技术广泛用于生物药品分离和纯化，主要包括液-固柱层析系统。液-固层析滞留分子机理有吸附、离子交换、亲和、分配、凝胶过滤等。主要层析技术如表7-13所表示。(一)层析原理一、层析基本知识生物药物的提取纯化技术专家讲座第67页生物药物的提取纯化技术专家讲座第68页在填充床中进行层析，是最为常见层析操作。层析柱内填充层析材料，含有样品液体(尽能够浓缩)加到柱顶部(这称为顺上柱)，然后加入洗脱剂，在重力或压力作用下，向下流动，流经填充床层析柱内固定相，依据组分与固定相之间相互作用力，目标物分子在固定相和流动相中分配，因而在每一相中均停留一定时间。在固定相中停留时间短分子将很快地被流动相带走，而在固定相中停留时间长分子在柱中流动较慢。不一样种类分子因它们在不一样相中分配差异，而被分离成不一样区带。所以，层析是利用不一样组分在层析介质中迁移速度差异而进行分离纯化。其基本原理如图7-20所表示。生物药物的提取纯化技术专家讲座第69页生物药物的提取纯化技术专家讲座第70页层析柱操作取决于许多原因，如所用介质、洗脱剂空柱流速、柱孔隙率、介质可渗透性能、组分在固定相和流动相中分配系数、处理量等原因。生物药物的提取纯化技术专家讲座第71页

不一样组分所形成区带相隔越远，这说明层析柱选择性能越好；不过当组分在柱中向下移动时，往往会产生扩散，表现为区带变宽，在一定长度色谱柱内所产生区带越窄，色谱系统效率也就越高。(二)层析两个基本问题：区带分离和峰形变宽生物药物的提取纯化技术专家讲座第72页

选择性和效率是相辅相成：效率高色谱系统，即使其选择性较差，也能对被分离组分进行很好分离(即区带之间不会重合)。一样道理，选择性好系统，即使它效率较差，也能使物质得到良好分离。生物药物的提取纯化技术专家讲座第73页(四)层析流动相操作方式

层析分离照操作方法主要有迎头法、置换法和洗脱法。当前主要以洗脱法为主。(三)层析分辨率分辨率可定义为两个被分离区带之间宽度与区带宽度之比值。若两个被分离区带之间宽度越大，每个组分区带宽度越小，则分辨率越高，分离效果越好。生物药物的提取纯化技术专家讲座第74页

柱式层析系统组成主要是蠕动泵、层析柱、检测器、统计仪和部分搜集器。试验室所用多为玻璃柱，工业所用层析柱用金属或聚丙烯材料制成。层析用介质种类很多，如表7-14所表示。(五)层析装置和操作生物药物的提取纯化技术专家讲座第75页层析操作包含：装柱、加样、洗涤、洗脱和再生。生物药物的提取纯化技术专家讲座第76页

装柱质量好坏，对层析分离效果影响很大；尽可能清液上柱；洗脱前普通要用清水或缓冲液将杂质洗涤下来；要依据被吸附物特点(如组分溶解度，吸附剂性质，洗脱溶剂极性等)来选择适当洗脱剂，然后采取恒定洗脱法、逐次洗脱法或梯度洗脱法进行洗脱；目标物洗下后，要用再生剂处理层析介质。生物药物的提取纯化技术专家讲座第77页

离子交换色谱利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结协力差异进行物质分离操作技术。二、离子交换技术

生物药物的提取纯化技术专家讲座第78页离子交换法生物药物的提取纯化技术专家讲座第79页常见离子交换剂分为离子交换树脂、大孔离子交换树脂、离子交换纤维素和葡聚糖凝胶离子交换剂等。各种交换剂均可按其可解离交换基团分为阳离子交换剂(强酸、中强酸、弱酸)和阴离子交换剂(强碱、中强碱性和弱碱性)两大类。生物药物的提取纯化技术专家讲座第80页离子交换法广泛用于提取抗生素、氨基酸、核苷酸、有机酸及生物大分子。在生物制药工业中，发酵培养液中同时存在着各种离子，目标物离子与树脂亲和力越大，就越轻易被树脂吸附。离子化合价与水合半径、溶液酸碱度都会影响交换选择性。生物药物的提取纯化技术专家讲座第81页将大网格离子交换树脂功效团去掉，仅保留多孔骨架后，其性质就可和活性炭、硅胶等吸附剂相同，这种称为大网格聚合物吸附剂。大网格吸附剂是一个非离子型共聚物，它能够借助范德华力从溶液中吸附各种有机物质。三．大网格聚合物吸附生物药物的提取纯化技术专家讲座第82页大网格吸附剂吸附能力，不但与树脂化学结构和物理性能相关，而且与溶质及溶液性质相关。依据“类似物轻易吸附类似物“标准，普通非极性吸附剂适宜于从极性溶剂(如水)中吸附非极性物质；反之亦然；而中等极性吸附剂则对上述两种情况，都含有吸附能力。生物药物的提取纯化技术专家讲座第83页大网格吸附剂含有孔隙小，选择性好，解吸轻易，机械强度好，可重复使用和流体阻力较小优点。能够用于弱电解质或非电解质或非离子型物质。

生物药物的提取纯化技术专家讲座第84页

凝胶过滤又称为凝胶扩散层析、排阻层析、分子筛层析等。凝胶层析柱中装有多孔填料，如交联聚苯乙烯；多孔玻璃、多孔硅胶、交联葡聚糖等，这些固体载体，含有细微孔，其孔径大小可准确控制，溶剂分子能够自由出入，溶质分子依据分子大小，在孔中扩散情况则很不相同。大分子只能进入较大孔内，小分子不但能进入大孔内，而且也能进入小孔内，因为大分子因为所经过旅程较短，先被溶剂带出，而小分子溶质后被洗脱下来。另外，分子形状及溶质与凝胶之间存在非特异性吸附作用也影响洗脱结果。(一)凝胶层析基本原理四、凝胶过滤(Gelmtration)生物药物的提取纯化技术专家讲座第85页层析(色谱）生物药物的提取纯化技术专家讲座第86页分子筛—凝胶过滤法生物药物的提取纯化技术专家讲座第87页生物药物的提取纯化技术专家讲座第88页用交联葡聚糖凝胶可分离相对分子质量数百到数十万物质，用琼脂糖凝胶可分离相对分子质量为数十万到上亿物质。粘度高溶液会显著影响分辨率，凝胶还轻易受到蛋白质阻塞。

凝胶材料有葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、微孔玻璃等。生物药物的提取纯化技术专家讲座第89页凝胶过滤和层析放大方法较为简单。首先要对试验室所取得纯化方案进行优化。再放大时，先要保持柱床高度、线性流速及上样浓度不变，然后增加上样量，增加体积流速和柱直径。(二)凝胶过滤及层析放大生物药物的提取纯化技术专家讲座第90页

选择凝胶基质时要考虑原因有：操作模式、分辨率(通常基质颗粒直径越小，分辨率越高)及基质稳定性能。

生物药物的提取纯化技术专家讲座第91页亲和层析主要过程是：(1)配基固定化，即选择适当配基与不溶性载体偶联，或共价结合成含有特异亲和性分离介质；(2)吸附样品，用亲和层析介质选择性地吸附生物活性物质，杂质不能被吸附而在洗涤时被去除；(3)样品解吸(洗脱)，选择适宜条件，使被吸附在亲和介质上生物活性物质解吸下来。第六节亲和层析一．亲和层析概述生物药物的提取纯化技术专家讲座第92页亲和层析生物药物的提取纯化技术专家讲座第93页生物亲和层析包含以下类型：疏水反应层析、金属螯合亲和层析、免疫亲和层析、共价亲和层析、固定化染料亲和层析、特殊基团亲和层析、亲和分配、亲和电泳、亚基交换层析、高压亲和层析、定量亲和层析、膜亲和层析、置换亲和层析。1．亲和层析技术类型生物药物的提取纯化技术专家讲座第94页

载体是与配基亲和结合层析介质，在亲和层析中作用是使配基固定化，同时提供形成亲和正确两物质特异性结合空间环境。惯用载体有纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶，多孔玻璃珠等。2．亲和层析载体(Matrix)和配基(Ligand)生物药物的提取纯化技术专家讲座第95页在亲和层析中起可逆结合特异性物质称为配基。按照亲和层析原理，亲和层析任何一方都可作为配基，普通用小分子量亲和配基分离蛋白质，但也能够反过来，用固定化配基专一性蛋白质来纯化小分子量配基。

生物药物的提取纯化技术专家讲座第96页(2)抗体与抗原、病毒、细胞；在生物亲和层析中，可利用下述生物亲和关系进行分离纯化。也可将配基分为两大类：通用配基和特殊配基。特殊配基包含以下一些类型：(1)酶与底物或底物类似物、酶抑制剂、辅助因子(如辅酶，金属离子)；生物药物的提取纯化技术专家讲座第97页

通用配基包含蛋白质A-SepharoseCL-4B、conA-Sepharose、小扁豆外源性凝集素、小麦芽外源性凝集素等。(3)激素、维生素与受体蛋白和载体蛋白；(4)外源凝集素(Lectin)与多糖化合物、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞；(5)核酸与互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合酶及核酸结合蛋白。生物药物的提取纯化技术专家讲座第98页配基偶联是采取化学合成方法，将配基与载体结合在一起。不一样配基种类有不一样方法。有时，可在载体和配基之间插入一个“接枝”或称“手臂”，以消除空间障碍，对提升吸附容量有利。生物药物的提取纯化技术专家讲座第99页亲和层析选择性非常好，所以可降低提纯步骤。不过亲和介质普通价格昂贵，处理量不大，大规模应用较少，在试验室制备时，普通只是在纯化后期使用。3．亲和层析优缺点生物药物的提取纯化技术专家讲座第100页

基本原理是生物大分子中功效团与层析剂上互补结构形成可逆性共价键。二、共价亲和层析

含有共价反应活性二硫键层析剂可用葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶为载体。现已经有商品化供给层析介质。生物药物的提取纯化技术专家讲座第101页

基于疏水特征吸附功效，是疏水层析技术基础。将一系列长度不一样碳氢化合物接到琼脂糖载体上，从而得到一系列对应疏水性琼脂糖层析介质，可用它们从粗提取液中分离纯化一些可溶性蛋白质。三、疏水层析

理想疏水配基应该是亲水性，而且是生物惰性，不应该产生非特异性二次吸附。琼脂糖最惯用。生物药物的提取纯化技术专家讲座第102页盐析离子存在会增强蛋白质吸附在碳氢化合物接枝琼脂糖上，而盐溶离子则可用来洗脱被强烈吸附蛋白质。在高浓度盐析离子(如硫酸铵)存在下进行吸附是当前最常见操作方法。经过逐步降低盐浓度而洗脱。当洗脱液表面张力降低到蛋白质表面张力时，蛋白质就开始洗脱下来。在水相环境中，温度和pH对吸附和洗脱都有影响。疏水层析可用于蛋白质纯化。生物药物的提取纯化技术专家讲座第103页

蛋白质分子能够与金属离子发生亲和反应，并与之结合，可用于吸附纯化蛋白质。四、固定化金属离子亲和层析固定化金属离子亲和层析柱制法：将柱子浸没于某种金属离子(如Cu2+、Zn2+、Ni2+、CO2+)缓冲溶液中，直至螯合到固定相上金属离子和溶液中金属离子到达平衡。固相载体，通常是硅或多聚物(如交联化琼脂糖、葡聚糖)，与配位体(如亚氨基二乙酸，IDA)共价连接。当在缓冲溶液中，浸泡平衡后，经洗涤，可将含有生物活性物质样品上柱，与固定化金属-配基复合物有亲和力分子都将被滞留，其余则流出柱外。生物药物的提取纯化技术专家讲座第104页若要将蛋白质从柱上洗脱下来，则可经过改变盐浓度、改变pH，或由竞争性试剂将蛋白质置换下来，这些方式机理都是经过降低固定化金属离子和蛋白质之间亲和常数。可采取分级洗脱或梯度洗脱方式。生物药物的提取纯化技术专家讲座第105页IMAC方法主要优点是：可用不一样金属离子固定到螯合载体上，所以可用一个更强螯合剂将所使用螯合剂洗脱下来，从而实现再生。螯合剂较稳定，金属结合特征不会大幅下降。经过选择适宜金属离子，可选取不一样分离方法；将不一样金属离子固定到柱上，可实现蛋白质和配基之间不一样吸附特征。在大多数情况下，从IMAC柱上洗脱下来蛋白质，依然含有生物活性。生物药物的提取纯化技术专家讲座第106页

抗原和抗体作用含有高度专一性，而且它们结合亲和力极强。所以用适当方法将抗原或抗体结合到层析剂上，便可用来有效地分离和纯化各自互补免疫物质。五、免疫亲和层析生物药物的提取纯化技术专家讲座第107页免疫亲和层析有时也称为抗体亲和层析，该技术惯用蛋白A和蛋白G对于各种起源免疫球蛋白IgGFc区域高度亲和和高度专一性结合为基础。用这些蛋白作为配基与载体(如琼脂糖)结合来制备层析载体。生物药物的提取纯化技术专家讲座第108页

一些有机染料如蒽醌化合物和偶氮化合物含有类似于NAD+结构，所以一些需要核苷酸类物质为辅酶酶，对这些染料有一定亲和力，假如这些染料作为配基共价偶联到纤维素或琼脂糖等多糖载体上，就能制得染料亲和层析柱。亲和染料层析已成功地分离纯化了许多酶。六、染料配基层析生物药物的提取纯化技术专家讲座第109页

凝集素是一类能与糖残基专一性结合蛋白质，所发生结合反应是可逆。它们能与多糖、糖蛋白及红细胞和肿瘤细胞凝集体产生专一性结合。与固定化凝集素结合物质可用竞争性结合试剂或离子浓度梯度洗脱下来。

七、凝集素亲和层析生物药物的提取纯化技术专家讲座第110页置换层析是指吸附在层析柱上一个组分被另一个组分或试剂置换出层析柱技术。首先用起始缓冲液平衡，再用一样缓冲液溶解或充分透析平衡样品上柱；然后再由一样缓冲液配制置换剂溶液进行置换洗脱。因为置换剂对层析柱中固定相亲和性大于被分离样品亲和性，当加入置换剂后，置换剂前沿迫使样品最终后沿组分解吸附，这一被解吸附组分又去置换前面亲和性弱组分。这么不一样组分因为其对固定相亲和能力不一样，在对吸附部位竞争和相互置换中，按照各组分对固定相亲和力大小而被分离并形成相互毗邻无拖尾纯组分峰区带。八、置换层析生物药物的提取纯化技术专家讲座第111页置换剂在被分离样品后面移动，推进着样品区带以相同速度向前移动。在置换层析中，样品分离是因为被吸附组分之间对固定相吸附部位直接竞争作用结果。这种直接竞争造成各组分按照它们对固定相亲和性大小形成一置换序列，而且在置换剂推进下，以相同速度向下移动。理想置换洗脱图谱中，每一组分不是形成钟罩形洗脱曲线，而是形成矩形平台洗脱峰。相毗邻各组分平台洗脱峰组成了一个台阶式层析图谱。生物药物的提取纯化技术专家讲座第112页图7-25是置换层析原理图。

生物药物的提取纯化技术专家讲座第113页置换层析所使用层析系统与洗脱层析相同。如可用吸附层析、离子交换层析、反向层析等。整个操作过程包含层析柱平衡，上样，加置换剂置换，分步搜集，层析柱再生。置换层析允许上样量能够比传统常规层析高得多，而且样品组分是以浓缩状态被分离。生物药物的提取纯化技术专家讲座第114页这种技术将蛋白质等物质等电点特征与离子交换色谱特征结合在一起，实现分离。首先假定用阴离子交换剂分离某种蛋白质，当介质pH值低于其等电点时，不与阴离子交换剂发生交换，而是伴随洗脱液向下移动。当环境pH值高于蛋白质等电点时，才可与离子交换剂结合。在洗脱过程中，环境pH值是不停下降，当pH下降至蛋白质等电点之下时，蛋白质又重新脱离交换剂而被洗脱，移至pH大于等电点时又重新结合，这么不停重复，直至蛋白质从柱下流出。1、原理九、色谱聚焦生物药物的提取纯化技术专家讲座第115页当某种蛋白质在柱上随洗脱液下移至等电点处时，其移动速度显著减慢。假如此时再加入另一份含有相同蛋白质组分样品，该蛋白质将以洗脱液速度下移，直至追到上一次进样、正在慢速移动、靠近等电点处蛋白质处，从而实现聚焦。第二个样品加入时间要掌握好，必须在第一个样品蛋白质峰还未洗脱之前加入，不然就不能聚焦。生物药物的提取纯化技术专家讲座第116页pH梯度形成：色谱聚焦系统pH梯度，是利用离子交换剂本身带电基团缓冲作用自动形成。如选取阴离子交换剂，色谱柱先用起始缓冲液平衡到pH9，洗脱液pH选定为6，加入洗脱液，开始加洗脱液时，流出液pH值靠近于9，伴随洗脱液加入，流出液pH值逐步下降，最终柱内完全被洗脱液所平衡，流出液pH到达6。生物药物的提取纯化技术专家讲座第117页多缓冲交换剂：用于色谱聚焦交换剂是一个专门开发交换剂，商品通常是以悬浮液形式提供。缓冲剂也是专门开发两性电解质缓冲剂，由分子量大小不一样各种组分多羧基多氨基化合物组成。与这两种多缓冲剂相匹配多缓冲交换剂通常以无菌液体形式提供，用前加以稀释。2．交换剂和缓冲液体系生物药物的提取纯化技术专家讲座第118页3、操作步骤生物药物的提取纯化技术专家讲座第119页在含蛋白质溶液中，应用100～500MPa高压可使多聚体蛋白质解离成亚基，且不会使其失活。不过当压力高于600MPa以上时，蛋白质则会产生不可逆失活。十、高压亲和层析生物药物的提取纯化技术专家讲座第120页大规模纯化蛋白质初步阶段，处理量大，但分辨率要求不高，并不要求马上就采取层析技术，可先用分步沉淀、盐析或有机溶剂沉淀等方法。假如蛋白质数量不多，含量较低样品，也可用分辨率和处理量中等离子交换色谱技术，必要话，也可采取高分辨率、低容量亲和层析技术和等电聚焦。十一、合理设计层析方案生物药物的提取纯化技术专家讲座第121页

免疫亲和层析和反相层析易使蛋白质变性，不能用于纯化活性蛋白质，离子交换色谱法是较为普遍使用分离活性蛋白质方法。对于很敏感蛋白质，在分离纯化时，分离纯化步骤尽可能少，且不要频繁变换缓冲剂。1．保留蛋白质生物活性需注意问题生物药物的提取纯化技术专家讲座第122页在设计蛋白质纯化步骤时，要充分利用各种蛋白质之间性质差异。以下所列出是最主要一些特征：2．利用蛋白质差异来设计分离步骤生物药物的提取纯化技术专家讲座第123页

(1)电荷蛋白质中带电氨基酸百分比各不相同，在一定pH下，净电荷也不一样。所以能够利用这一性质采取离子交换色谱法分离纯化蛋白质。蛋白质带电荷与离子交换树脂上固定载体所带电荷相反，蛋白质与载体结合强度取决于蛋白质上电荷数量。对于大规模(100g蛋白质)分离纯化，常采取纤维素为基质树脂，流速较快，柱床体积也较大，但此法分辨率不高。欲得到高分辨率纯化结果，可用琼脂糖为基质树脂，但其处理量较小。

生物药物的提取纯化技术专家讲座第124页假如蛋白质量小于10mg，则可采取快速蛋白液相层析法。有预装柱配套，柱直径小，分辨率很高。假如两种蛋白质在某一pH值带有相同电荷，不过在另一个不一样pH值，则带不一样电荷。所以在一个分离纯化过程中，经常分为若干个离子交换步骤。这又分为几个情况，如可使用同一个树脂，但可设定不一样平衡时pH值，或使用两种相反电荷树脂，比如，第一个树脂结合有带负电羧甲基基团(CM)，另一个带有正电二乙氨乙基基团(DEAE)。生物药物的提取纯化技术专家讲座第125页利用蛋白质之间等电点差异，可开发一些分离纯化方法。如层析聚焦法，这是一个离子交换技术，蛋白质结合到阴离子交换剂上，然后经过连续地降低缓冲液pH值，将蛋白质依据其等电点次序依次洗脱。这是一个分辨率及容量相当高分离技术，可用于初步纯化蛋白质深入纯化。另一个技术是等电点聚焦，此法处理容量不大，但分辨率很高，适于分离蛋白质混合物。生物药物的提取纯化技术专家讲座第126页(2)分子大小

超滤技术及分子排阻层析就是依据蛋白质分子大小性质而设计。分子排阻法分辨率不算高，不过假如目标物蛋白质与其它杂蛋白质分子量相差很大，则此法分辨率还能够。因为受柱体积影响，此法分离容量也不高。凝胶电泳也是基于蛋白质大小，小分子蛋白质移动速度快，该技术分辨蛋白质能力很强，但蛋白质易失活，故惯用于蛋白质分析。生物药物的提取纯化技术专家讲座第127页(3)专一性结合

许多蛋白质经过与一些成份结合而含有生物功效，如酶与基质结合，有时与活化剂或抑制剂结合，激素与受体结合，抗体与抗原结合。许多亲和层析技术就是利用上述特征。生物药物的提取纯化技术专家讲座第128页依据目标蛋白质与低分子量化合物相互反应(如酶与基质或基质类似物)亲和方法专一性普通不强，因为配基可与混合物中若干种蛋白质结合。更新奇亲和分离方法是使用双功效NAD+衍生物，更有选择性地亲和结合脱氢酶。生物药物的提取纯化技术专家讲座第129页(4)特殊性质

利用一些蛋白质热稳定性，先将样品加热处理，耐热性能不好杂蛋白变性沉淀，而耐热仍留在溶液中。也可利用蛋白质在极端pH环境下稳定性能，对于这种情况，可将样品调至低pH或高pH，保温一段时间，杂蛋白就能够沉淀下来。生物药物的提取纯化技术专家讲座第130页

最终值得一提是，假如需要话，也可为一些蛋白质设计出一些特殊性质，以帮助它们纯化。如在蛋白质上加入一段聚精氨酸或聚赖氨酸，以增加其电荷，使该蛋白质在离子交换层析上得到纯化。或者将一段聚合组氨酸引入到固定化金属亲和层析上。生物药物的提取纯化技术专家讲座第131页在纯化初步阶段，可经过测定在280nm处吸光度确定其含量。在纯化后期阶段，可用更为准确方法。3．测定和数据处理生物药物的提取纯化技术专家讲座第132页

层析技术在重组蛋白分离纯化方面发挥了越来越大作用。但层析技术并不能处理全部分离纯化问题，层析技术必须和其它技术相结合，并考究分离纯化步骤合理安排，才能得到好分离纯化效果。常见安排以下：4．重组蛋白质分离纯化操作次序生物药物的提取纯化技术专家讲座第133页盐析→凝胶过滤→离子交换有机溶剂沉淀→亲和吸附→染料配基吸附等有机溶剂沉淀→离子交换→盐析→凝胶过滤有机溶剂沉淀→亲和吸附→盐析→凝胶过滤亲和吸附→盐析→凝胶过滤生物药物的提取纯化技术专家讲座第134页也可按以下方法选择组合：生物药物的提取纯化技术专家讲座第135页大分子产物分离纯化普通需要较长时间。决定纯化时间原因有很多，但最主要可能是大多数提取纯化过程都是利用物质扩散性能；酶是一个热敏性产品，在分离操作过程中，普通都要保持在0℃左右，低温有利于酶活力保留，但会延长分离纯化时间；5．纯化所需时间生物药物的提取纯化技术专家讲座第136页为了操作者安全，大多数国家对于含有外源基因重组细胞贮存和处理都有明确法律要求，只要含有外源DNA细胞是存活，这些细胞都要放置在有特殊安全办法密封装置内，当这些细胞被杀灭或适当处理后，才能对细胞提取物深入加工。6．重组蛋白质特殊提取精制技术