纤维素酶专业知识讲座

内容

1背景

2纤维素及纤维素酶介绍

3国内外纤维素酶研究热点纤维素酶专业知识讲座第1页研究背景

能源危机

高油价，石油、天然气等化石燃料枯竭,如石油大约为1180~1510亿吨，大约在2050年左右枯竭，天然气贮备预计在131800~152900兆立方米。年开采量维持在2300兆立方米，将在57~65年内枯竭。煤储量约为5600亿吨，能够供给169年。粮食紧缺

全世界饥饿人口：10亿纤维素乙醇

原料起源广:作物秸秆

(1.5×1012T/年)，大部分以焚烧形式被处理掉，造成大量资源浪费和环境污染。价格低：50美分/加仑（美国Novozymes企业）工业用酶需求增大

酶产值：1×1010美元/年

纤维素酶专业知识讲座第2页Worldenergyusagewidthchart纤维素酶专业知识讲座第3页汽油价格纤维素酶专业知识讲座第4页FLAGPOLICYDURINGTHE1973oilcrisis

1979energycrisis

纤维素酶专业知识讲座第5页Lineatagasstation,June15,1979纤维素酶专业知识讲座第6页全球粮食危机纤维素酶专业知识讲座第7页粮农组织食品价格指数和农产品价格指数

纤维素酶专业知识讲座第8页StrawsofCrop纤维素酶专业知识讲座第9页纤维素分子结构分子量：

1.5×106～1.84×106，相当于11300个葡萄糖残基，这些纤维素分子以氢键组成平行微晶束，约60个为1束。纤维素弯曲模型:Hermans(20世纪40年代)提出纤维素(Cellulose)是植物细胞壁主要组分之一,占植物秸秆干质量40%～50%。纤维素(Cellulose)：是由D-吡喃型葡萄糖基经β-1,4糖苷键联结而成直链多糖直链状大分子纤维素折迭起来，形成含有高结晶基本组成单位，由这种基本组成单位集中起来组成微小结构单位，再由很多微小单位组成纤维素。Figure1Hermans式纤维素椅式结构纤维素酶专业知识讲座第10页纤维素酶介绍

纤维素酶：指由生物产生一个多组分混合蛋白质，在适当条件下，能使不溶性纤维素材料水解成可溶性糖生物催化剂总称。

纤维素酶结构

Fig.1Modelofcellulaseenzyme,producedbyT.fusca(禾草腥黑粉菌),basedonPDBstructure1JS4.催化活性中心到两个含有独立活性结构域:含有催化功效结构域(Catalyticdomain,CD),

含有结合纤维素功效结构域(Cellulosebindingdomain,CBD),

二者之间由一段高度糖基化linker相连。整个分子呈楔形,球状核区表示包含催化位点和底物结合位点CD区。少数没有CBD。当前被说明催化结构域T.reeseiCBHⅡ催化域结构,它是由α/β组成筒状结构:由5个α螺旋和7条β链组成,活性部位由两个延伸至表面环(loop)以形成一个隧道状(tunnel)结构,长度大约2nm,包含4个结合位点,水解糖苷键发生在第2和第3结合位点之间。纤维素酶专业知识讲座第11页纤维素酶性状真菌纤维素酶：以水解酶机制和氧化酶机制降解纤维素；细菌纤维素酶：形成多酶复合体结构又称纤维小体(Cellulosome)而起作用。能够愈加彻底有效降解天然纤维素。白色，溶于水，高温失活：最适温度在45～65℃之间，受二苯乙烯苷、葡萄糖酸-1,5-内酯等抑制表1产纤维素酶菌种特点纤维素酶专业知识讲座第12页纤维素酶作用机制

纤维二糖酶C1酶CＸ酶依据酶作用方式纤维素酶分为：纤维素酶

CＸ1酶：内切型酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-（1，4)糖苷键，生成纤维糊精与纤维二糖。CＸ2酶：外切酶，它从水合性纤维素分子非还原端作用于β-（1，4)糖背键，逐步切断β-(1,4)糖节键生成葡萄糖。纤维二糖酶则作用于纤维二糖，生成葡萄糖(何明清，1994)。Shoemaker、Goeran和Jinshce等人相继发觉，内切葡萄糖酶、纤维二糖水解酶及β-葡萄糖苷酶均存在2～4个同功酶，对于这些同功酶功效，当前还未见有明确阐述，所以酶解机理还有待深入研究和探讨。

当前，已发觉70种纤维素酶。以上几个酶往往相互协同作用纤维素酶专业知识讲座第13页CharacterofReaction

Hydrolysisof1,4-beta-D-glycosidiclinkagesincellulose,licheninandcerealbeta-D-glucans.

Fig.2

Characterof

HydrolysisReaction纤维素酶专业知识讲座第14页纤维素水解过程

Fig.3Mechanismofcellulolysis

Breakageofthenon-covalentinthecelluloseHydrolysisoftheindividualcelluloseitintosmallersugars

Hydrolysisofdisaccharidesandtetrasaccharidesintoglucose纤维素酶专业知识讲座第15页纤维素酶起源

真菌(mainly)：

木霉属(Trichoderma)、曲霉属（Aspergillus）和青霉属(Penicillium），如绿色木霉菌(Trichodermaviride),康宁木霉菌(Trichodermakoningii),黑曲霉（Asp.niger），绳状青霉、变幻青霉等.

细菌:

好氧菌：如纤维单胞菌属（Cellulomonas）、纤维弧菌属（Cellvibrio）、噬胞菌属（Cytophaga）厌氧菌：厌氧性芽孢梭菌属（Clostridium）、产琥珀酸拟杆菌（Bacteroidessuccinogenes）、牛黄瘤胃球菌（Ruminococcusflavefaciens）、白色瘤胃球菌（R.albus）、溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibriofibrisolvens）等超古菌：激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)等.

放线菌:好氧放线菌(Actinomycetales)：生二素链霉菌(Streptomycesambofaciens)

高温单孢菌属(Thermomonospora):弯曲高温单孢菌(Thermomonosporacurvata)及假诺卡氏菌属等

植物、动物及原生动物(little):

蜗牛(snail),蟑螂(cockroaches)等.

纤维素酶专业知识讲座第16页纤维素酶应用：纤维素酶食品生产医药生物燃料造纸洗涤剂纺织工业纤维素酶专业知识讲座第17页针对以上不知，国内外研究主要集中在以下几方面:1、菌种选育：构建表示含有较高酶活力纤维素酶菌株;2、酶功效改造：经过分子改造来提升酶功效性;3、经过低成本发酵来生产酶制剂：添加可溶性诱导剂，如槐糖(sophorose),纤维二糖(cellobiose),乳糖(lactose)和寡糖(cellooligosaccharides)纤维素酶专业知识讲座第18页纤维素酶在实际应用不足(1)技术上：纤维素酶对温度、湿度、酸碱度十分敏感,生产纤维素酶在保管、加工等过程中处理不妥就会失活,影响应用效果。(2)标准上：纤维素酶质量标准、校验方法标准,尤其是添加纤维素酶后产品质量标准,在我国还是空白。取得成效与预期目标相距甚远,原因主要有2个：纤维素酶专业知识讲座第19页今后对纤维素酶研究会重点集中在:①纤维素酶高产菌株选育：

对菌株进行改造,提升菌株生产能力及酶活性和稳定性，筛选极端条件下纤维素酶高产菌株②优化发酵条件：

改进发酵工艺,降低生产成本,使发酵产物易于分离纯化。③纤维素酶测定方法规范化：

包含要求标准菌株、标准测活方法、标准底物等。纤维素酶专业知识讲座第20页纤维素酶研究现实状况BokJD.等人从Thermotoganeapolitana中分离纯化到2个高热稳定性内切纤维素酶CelA、CelB,编码这2个内切纤维素酶基因已经被判定。Bronnenmeiar将一个起源于T.maritimaMSB8高热稳定性外切纤维素水解酶,最适温度为95℃,pH在6.0～7.5,该酶能水解微晶纤维素、羧甲基纤维素和β-葡聚糖形成纤维二糖和纤维三糖。来自S.solfataricusMT4β-糖苷酶已被纯化判定,该酶是一个同源四聚体,85℃以上对各种变性剂有极高抵抗力。编码该酶基因已在大肠杆菌中克隆和高效表示。用拟南芥（Arabidopsisthaliana）叶片、马铃薯或烟叶来表示热稳定性好AcidothermuscellulolyticusendoglucanaseE1。纤维素酶专业知识讲座第21页1987年,Love在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中克隆了最适生长温度为65℃极端嗜热厌氧菌（Caldocellumsaccharolyticum）β-葡萄糖苷酶,并完成测序。1996年Bergquist克隆栖热菌耐热纤维素酶耐热温度为70℃。1997年美国RBI企业开发103酶耐热温度100℃,最适酶促温度70～80℃。1998年THOMAS克隆到Streptomycesviridosporus内切纤维素酶基因并成功表示于Pichiapastoris中。年SPIRIDONOV尝试用放线菌（Thermobifidafusca）进行体外合成纤维素酶，发觉这一过程受celR基因调控。经过对比celR基因突变型与野生型差异，发觉celR为组成型表示基因，其DNA结合活性受翻译后修饰调控。年VANSolingen从湖底淤泥中筛选到了生产碱性纤维素酶放线菌菌株，经16SrDNA测序，初步判定为链霉菌属新种，并成功克隆到了纤维素酶基因cel12A，并将其利用大肠杆菌表示。纤维素酶专业知识讲座第22页纤维素酶生产液态发酵固态发酵生产方式胡奎娟等研究了木霉和黑曲霉混合发酵产木聚糖酶和纤维素酶，结果为：木霉和黑曲霉按4:6同时接种，在84h产纤维素酶活力到达230IU/g干物质，木聚糖酶活力到达1308IU/g干物质，与两菌纯培养相比，纤维素酶活力提升163%，木聚糖酶活力提升79.5%。邹水洋等对选育一株康宁木(Trichodermakoningii)QF202进行液态发酵生产纤维素酶和木聚糖酶.通摇瓶培养144h后，滤纸酶活1.49FPU/mL、β-葡萄糖苷酶活0.39U/mL、木聚糖酶活174.10U/mL.比一个商品纤维素酶糖化能力及总还原糖产量比商品纤维素酶分别提升了55%和40%,葡萄糖产量分别提升了33%和12%.纤维素酶专业知识讲座第23页

纤维素乙醇生产工艺pretreatment

Cellulosematerialcellulolysis

sugarsolution

fermentation

DistillationDehydration

95%alcoholover99.5%ethanolcellulase纤维素酶专业知识讲座第24页纤维素生产乙醇及其它化工产品关键纤维素糖化主要方法酸水解法：酸水解法中，稀酸水解所得糖化率低，高浓度强酸可有效水解纤维素，但其腐蚀性对人体有害，且所需工艺条件苛刻。酶水解法：用纤维素酶水解纤维素，在常温、常压条件下就能够.所以，用纤维素酶降解纤维素是当前纤维素利用研究中热点。稀酸预处理-酶解法：美国可再生能源试验室开发发酵工艺纤维素酶专业知识讲座第25页参考文件：[1]ZieglerMT，ThomasSR，DannaKJ.Accumulationofathermostableendo-1,4-β-D-glucanaseintheapoplastofArabidopsisthalianaleaves[J].Mol.Breed.，，6：37-46.[2]DaiZY，HookerBS，AndersonDB，etal.Improvedplant-basedproductionofE1endoglucanaseusingpotato：Expressionoptimizationandtissuetargeting[J].Mol.Breed.，，6：277-285.[3]GRAHAML.,etal.CharacteristicsofEnzymesProducedbyRuminococcusJlavefacienswhichDegradePlantCellWalls.JournalofGeneralMicrobiology.1979,110:21-27.[4]BARBELG.,etal.CellulolyticEnzymeSystemofThermoactinomycessp.GrownonMicrocrystallineCellulose.APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY.1978,36(4):606-612.[5]HARRYJ.GILBERT,GEOFFREPY.HAZLEWOODBacterialcellulasesandxylanases.JournalofGeneralMicrobiology.1993,139:187-194.[6]FREJ.STUTZENBERGER.CellulolyticActivityofThermomonosporacurvata:OptimalAssayConditions,PartialPurification,andProductoftheCellulase.APPLiEDMlcaosioLoGy.1972,24(1):83-90.[7]P.0.OLUTIOLA.CellulolyticEnzymesinCultureFiltratesofRhizoctonialamellifera.JournalofGeneralMicrobiology.1976,97:251-256.[8]A.D.COUTTS.FactorsInfluencingtheProductionofCellulasesbySporotrichumthermophile.APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY.1976,36(1):819-825.[9]MariamB.Sticklen.FeedstockCropGeneticEngineeringforAlcoholFuels.CROPSCIENCE.,47:2238-2246.[10]ELAINET.EVANS,etal.InvestigationofanendoglucanaseessentialfortheactionofthecellulasesystemofTrichodermareeseioncrystallinecellulose.Journalof'GeneralMicrobiology.1992,138:1639-1646.纤维素酶专业知识讲座第26页[11]ELAINET.EVANS.InvestigationofanendoglucanaseessentialfortheactionofthecellulasesystemofTrichodermareeseioncrystallinecellulose.Journalof'GeneralMicrobiology.1992,138:1639-1646.[12]Ta-TungWey,etal.MolecularCloningandSequenceAnalysisoftheCellobiohydrolaseIGenefromTrichodermakoningiiG-39.CURRENTMICROBIOLOGY.1994,28:31-39.[13]S.Zeilinger.,etal.NucleosometransactionsontheHypocreajecorina(Trichodermareesei)cellulasepromotercbh2associatedwithcellulaseinduction.MolGenGenomics.,270:46–55.[14]T.M.WOOD,etal.ObservationsontheComplexInteractionsInvolvedintheEnzymaticHydrolysisofCellulose.AppliedBiochemistryandBiotechnology.1984,9:313-315.[15]D.M.PHARR.PartialCharacterizationofCxCellulaseandCellobiasefromRipeningTomatoFruits1.PlantPhysiol.1973,51:577-583.[16]J.L.Wang,P.J.Gao.PCR-mediatedanalysisoftranscriptionofCBHIandIIgenesfromTrichodermapseudokoningiiandPenicilliumjanthinellum.BiotechnologyLetters.1999,21:321–324.[17]BASILJ.MACRIS.ProductionandCharacterizationofCellulaseandr-GlucosidasefromaMutantofAlternariaalternata.APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY.1984,47(3):560-565.[18]K.MAHALINGESHWABRHAA,etal.PurificationandcharacterizationofanextracellularP-glucosidasefromthethermophilicfungusSporotrichumthermophileanditsinfluenceoncellulaseactivity.JournalofGeneralMicrobiology.1993,139:2825-2832.[19]THOMASM.WOOD,SHEILAI.McCRAE.PurificationandSomePropertiesoftheExtracellularP-D-GlucosidaseoftheCellulolyticFungusTrichodermakoningii.Journalof'GeneralMicrobiology.1982,128:2973-2982.[20]ERICA.JOHNSON,etal..SaccharificationofComplexCellulosicSubstratesbytheCellulaseSystemfromClostridiumthermocellum.APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY.1982,43(5):1125-1132.纤维素酶专业知识讲座第27页[21]C.Thrane,etal..Substratecolonization,straincompetition,enzymeproductioninvitro,andbiocontrolofPythiumultimumbyTrichodermaspp.isolatesP1andT3.EuropeanJournalofPlantPathology.,

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