人生长激素重组蛋白的制备及其纯化

人生长激素重组蛋白的制备及纯化【摘要】目的：制备人生长激素重组蛋白（rhGH）为制备单克隆抗体打下基础及其建立GH检测方法。方法：本研究将rhGH质粒转化BL21(DE3)感受态细胞(Tf16分子伴侣)，挑取5个单克隆菌株诱导表达并进行可溶性表达的鉴定。结果：成功实现了rhGH蛋白的可溶性表达，并从中筛选出目的蛋白表达量最高的2号菌株；通过GSTrapFF1mL亲和层析柱纯化rhGH蛋白，得到了比较显著的结果；优化了2号rhGH菌株的诱导条件，结果显示，在25℃和0.5mmol/L浓度的IPTG诱导10h下rhGH蛋白的表达效果最好，并利用WB和ELISA鉴定了rhGH蛋白的表达情况。结论：本实验通过原核表达系统成功实现了rhGH的可溶性表达，并探索出了原核表达的最佳条件，为进一步研究rhGH结构和制备单克隆抗体打下基础。【关键词】重组人生长激素；大肠杆菌；纯化Preparation

and

purification

of

recombinant

protein

of

human

growth

hormone[Abstract]Objective:

The

preparation

of

rhGH

recombinant

protein

lays

a

foundation

for

the

preparation

of

monoclonal

antibodies

and

establishes

a

detection

method

for

GH.

Methods:

In

this

study,

rhGH

plasmid

was

transformed

into

BL21(DE3)

receptor

cells

(Tf16

molecular

companion),

and

five

monoclonal

strains

were

selected

to

induce

expression

and

identify

soluble

expression.

Results:

The

soluble

expression

of

rhGH

protein

was

successfully

achieved,

and

strain

No.

2

with

the

highest

expression

of

target

protein

was

screened

out.

The

rhGH

protein

was

purified

by

nickel

affinity

chromatography.

The

results

showed

that

the

rhGH

protein

could

be

eluted

with

imidazole

at

the

concentration

of

500

mmol/L.

The

induction

conditions

of

rhGH

strain

No.

2

were

optimized.

The

results

showed

that

the

expression

of

rhGH

protein

was

the

best

at

25

℃

and

0.5

mmol/L

IPTG.

Conclusions:

In

conclusion,

this

study

successfully

achieved

the

soluble

expression

of

rhGH

through

the

prokaryotic

expression

system,

and

explored

the

optimal

conditions

for

prokaryotic

expression,

which

laid

a

foundation

for

further

study

of

rhGH

structure

and

preparation

of

monoclonal

antibody.[Keywords]Recombinant

human

growth

hormoneE.

colipurification

目录TOC\o"1-3"\h\u183221前言 前言研究背景人生长激素的简介人的身体通过脑垂体前叶的嗜酸性细胞分泌出来生长激素。它是带有由191个氨基酸所构成的肽类激素，内含两对二硫键，相对分子质量大概为22kd。除此之外，该激素不会被糖基化修饰。重组表达的重组人生长激素（rhGH）与人体内源性生长激素具有等同作用REF_Ref15574\r\h[1]，其主要通过刺激肝脏分泌胰岛素样生长因子（IGF-1），作用于骨和软骨，引起身高的增长，同时能够促进人体蛋白质合成及脂质分解和脂质氧化，调节体内水盐平衡[2]。生产人生长激素通过两种方法，一种是从人的尸体中摘取脑垂体做材料,进行人工提取，但不久就被证实在人体无活性；另一种是目前主要的方法，用基因工程，常见的表达系统可分成两类[3]：一种是原核表达系统，其中，大肠杆菌是最常见的宿主，也是目前最广泛用于表达外源蛋白的表达宿主[4]，此外还有芽孢杆菌表达系统，另一种是真核细胞表达系统，比如酵母、哺乳动物细胞，其在真核蛋白表达和分离纯化工艺方面比大肠杆菌更有优势[5]。重组人生长激素的临床应用目前，体外补充生长激素是生长激素缺乏症患儿唯一的治疗方式，从1958年的人垂体提取生长激素，到今天利用基因工程技术合成，rhGH的大规模生产使其被广泛运用于生长激素缺乏症的相关治疗中，不仅能促进先天性卵巢发育不全综合征和慢性肾脏病患儿生长，同时还能协助治疗充血性心力衰竭、慢性阻塞性肺病、重症急性胰腺炎、严重烧伤，纠正低蛋白血症以及促进创面愈合[6]。重组人生长激素在体外诊断中的医用体外诊断（InVitroDiagnosis，IVD）是指将血液、体液、组织等样本从人体中取出，使用体外检测试剂、仪器等对样本进行检测与校验，按照方法学分为生化诊断、免疫诊断、分子诊断三大类[7]，其中免疫诊断具有高灵敏度、宽的线性范围、精确的定量检测、结果稳定、误差小以及操作简便等优点。抗原抗体是诊断试剂的核心，其质量决定了诊断的稳定性和灵敏度。受研发技术及生产工艺限制，我国体外诊断企业自产原材料能力有限且产能不足，体外诊断产品生产所需原材料多需从国外进口[8]。如今，我们都了解，主要用于体外诊断产品研发的核心因素其中包括:固定相原料、抗原或抗体来源、阻滞剂等。可以选择与目的分子高度特异能结合的抗原或抗体，是生产高效快速、具特异性试剂的最决定性因素。研究目的及意义体外诊断试剂行业产业链是由上游原材料、中游体外诊断试剂、下游服务和需求共同组成[9]，为了更好的服务体外诊断试剂研发与生产，从上游原料开始严格把关，选择高品质、稳定性好的诊断试剂原料。因此获取高纯度、高活性的rhGH不仅对于降低工业成本具有重要意义，还为制备抗生长激素抗体提供原料，最终服务于人血清中生长激素的检测。实验主要研究内容本实验以大肠杆菌BL21作为宿主细胞表达出rhGH蛋白，培养挑取5个单菌落进行菌落PCR和琼脂糖凝胶电泳，初步筛选出呈阳性克隆的菌株，对鉴定的5个菌株进行扩培与诱导表达，通过蛋白浓度测定和SDS凝胶电泳，验证其可溶性表达并筛选出表达量最高的菌株为后续实验所用；对筛选出的菌株采用GSTrapFF1mL亲和层析柱进行纯化，通过控制单一变量和SDS凝胶电泳判断rhGH原核表达的最适条件，最后用WB和ELISA进行鉴定和验证。

rhGH的表达及纯化条件优化实验材料质粒和菌株BL21(DE3)感受态细胞(Tf16分子伴侣)和GST-hGH重组质粒（均由实验室提供）。主要试剂和试剂盒表2-1主要试剂和试剂盒试剂名称生产厂家甘氨酸氯霉素氨苄青霉素过硫酸铵蛋白胨TrisL-阿拉伯糖氯化钠咪唑PCR试剂盒还原型谷胱甘肽考马斯亮蓝染色液苯甲基磺酰氟（PMSF）酵母粉琼脂糖GelRed异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）BCA蛋白定量试剂盒VazymeVazyme上海阿拉丁上海阿拉丁BiosharpBiosharp上海阿拉丁上海阿拉丁上海阿拉丁Vazyme北京普博欣公司上海碧云天上海碧云天BiosharpBiosharpBiosharp上海碧云天上海碧云天主要实验仪器和耗材表2-2主要实验仪器和耗材名称生产厂家0.22μm滤膜96孔板各种规格离心管各种规格枪头移液枪磁力搅拌器高速冷冻离心机PH离子计全自动高压灭菌锅超纯水系统分析天平超净工作台恒温振荡培养箱恒温金属浴多功能酶标仪超声细胞破碎仪PCR仪凝胶成像仪脱色摇床蠕动泵GSTrapFF1mL亲和层析柱电泳仪上海碧云天BiosharpBiosharpBiosharp赛默飞ITESTER上海一恒科学仪器有限公司上海精密科学仪器有限公司日本TOMY公司美国密理博公司上海力辰邦西仪器科技有限公司苏州安泰空气技术有限公司上海一恒科学仪器有限公司杭州瑞诚仪器有限公司德国Berthold公司上海一恒科学仪器有限公司Bio-RadBio-Rad上海一恒科学仪器有限公司上海一恒科学仪器有限公司美国GE公司Bio-Rad主要实验试剂配制方法表2-3主要实验试剂配制方法试剂名称配制方法LB液体培养基LB固体培养基氨苄青霉素溶液氯霉素溶液IPTG溶液L-阿拉伯糖溶液50×TAE溶液1%琼脂糖凝胶溶液10%SDS溶液10%过硫酸铵溶液超声缓冲液PMSF溶液5×Tris甘氨酸电泳液PBS溶液洗脱液包涵体裂解液10g蛋白胨、5g酵母粉、10g氯化钠，超纯水定容至1L。10g蛋白胨、5g酵母粉、10g氯化钠，琼脂粉15g，超纯水定容至1L。1g氨苄青霉素粉末，溶于10mL超纯水，0.22μm滤膜过滤，4℃保存。0.175g氯霉素粉末，溶于50mL超纯水，0.22μm滤膜过滤，常温保存。0.2235gIPTG粉末，溶于10mL超纯水，0.22μm滤膜过滤，-20℃保存。10gL-阿拉伯糖粉末，溶于50mL超纯水，0.22μm滤膜过滤，常温保存。3.72gNa2EDTA·H2O、24.2gTris醋酸调pH至8.5超纯水定容至100mL。0.5g琼脂粉，1×TAE定容至50mL。5gSDS粉末，超纯水定容至50mL，常温保存。1g过硫酸铵粉末，超纯水定容至10mL，4℃保存。5.844g的NaCl、3.152g的Tris-HCl、20mLTween20，超纯水定容至1L。0.871gPMSF粉末，异丙醇定容至50mL，-20℃保存。15.1g的Tris、5g的SDS、94g甘氨酸，超纯水定容至1L，常温保存。140mMNaCl、2.7mMKCl、10mMNa2HPO4、1.8mMKH2PO4调pH7.3。50mMTris-HCl,10mM还原型谷胱甘肽调pH为8.0。1.576gTris-HCl、360.36g尿素、2.922g的NaCl、8.71g的L-精氨酸、43.55g的L-精氨酸、1mLEDTA溶液（5mol/L）用超纯水定容至500mL于4℃保存。实验方法与步骤rhGH质粒的转化在超净工作台内进行操作，将GST-hGH重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，根据以下具体方法进行操作：将BL21（DE3）感受态细胞从-80℃的冰箱中拿出来，放到冰面上化开后，用移液枪吸取50μL感受态细胞加入1.5mLEP管中，再换掉移液枪头，吸取5μL的rhgh质粒，并吹打混和在一起。最后，将混合物放入冰水浴中静置30分钟；然后42℃水浴热激90s装有混合物的EP管，然后用夹子夹起快速转移至冰水浴中静置2min；用移液器向EP管中加入500μlLB液体培养基（未添加抗生素），吹打混合均匀后将其放入37℃的恒温培养箱对其以220rpm/min振荡培养1h（以促使质粒抗性基因的表达，为后续筛选做好准备）；培养完成后取出，4000rpm离心1min，然后弃去300μL的上清培养基，吹打混匀剩余培养基[10]；用移液器吸取30μL菌液然后用涂布器将其分布均匀的涂布于LB固体培养基（含氨苄青霉素100mg/L）上，倒置于37℃恒温培养箱一晚，等待菌落生成。菌落PCR鉴定取5个灭菌的1.5mLEP管，用移液器各加1mL的含氨苄青霉素100mg/L的LB液体培养基；取出过夜的平皿，在超净工作台中先将镊子灼烧，冷却后（用镊子夹取枪头时不粘连即可）夹取一个10μL的枪头戳入一个单克隆菌株，然后将枪头放入EP管，在37℃恒温培养箱220rpm/min振荡培养10h；（对其进行鉴定，以确定目的基因是否正确插入载体。）取菌液为模板按表2-4进行反应，PCR反应程序如表2-5所使。

表2-4菌液PCR体系体系组分体积（μL）ddH2O10xPCRBufferdNTPFP-1(10μM)RP(10μM)TapDNA酶Totalvolume7.5210.50.5112.5表2-5菌液PCR反应程序循环步骤温度时间循环数预变性变性退火延伸彻底延伸94℃98℃60℃72℃72℃1min10s15s30s5min30个1%琼脂糖凝胶电泳鉴别PCR阳性产物。配制电泳缓冲液（1×TAE）：使用分析天平称取0.5g琼脂糖，然后倒进锥形瓶中。再用1×TAE缓冲液将其定容至50mL并放入微波炉中稍加溶解。冷却至50℃左右后，加入1μL染色液并均匀混和，用移液枪加入制胶板中，插上点样梳，静置，等待30分钟凝固后，垂直向上拔出点样梳。最后，将胶板放入盛有1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，再加入电泳缓冲液，直到胶板被完全淹没。用移液枪吹打25μLPCR产物与5μL10×LoadingBuffer的混合物，充分混合，然后加入样品孔中，待加完样品与maker后，盖上电泳槽盖，接上电极插头，电压150V开始电泳，待溴酚蓝移至凝胶底部，停止电泳，取出凝胶，在紫外灯下进行观察和鉴定(条带位置正确的所对应菌液可确定为阳性克隆转化子)。对转化成功的菌株留一部分保存于4℃冰箱待下一步扩培，剩余菌液中加入等体积的甘油混合在一起后进行-80℃保种。常温诱导蛋白表达SDS电泳验证从4℃冰箱中取出经琼脂糖凝胶电泳验证成功的菌株进行扩培、37℃诱导表达后进行SDS电泳验证。以温度为37℃、转速为200rpm/min的条件下，将保留的各管菌液用LB液体培养基（含氨苄青霉素100mg/L）在恒温振荡培养箱中振荡扩培至50mL体系，当菌液达到OD600=0.4~0.6的条件后加入工作浓度为1.0mmol/L和2.0mmol/L的IPTG和L-阿拉伯糖，继续诱导表达16小时。到时间后收集菌体并对其超声裂解后进行SDS电泳验证（初步鉴定所挑取的菌株的目的蛋白在全菌中是否表达），剩余样品放于-20℃冰箱贮存备用。鉴定rhGH原核表达载体rhGH质粒的大量表达复性与扩培将通过筛选的菌株接种至LB液体培养基（含氨苄青霉素100mg/L），接种量为1%，在恒温振荡培养以温度为37℃，转速为220rpm/min振荡培养，直至OD600=0.6-0.8（约2小时）；诱导和收菌吸取1mL菌液出来留作对照品，剩余菌液进行5分钟冰水浴后加入诱导剂终浓度为1.0mmoL/L的IPTG和2.0mmoL/L的L-阿拉伯糖，以30℃的温度，220rpm/min的转速诱导表达10h后，在4℃，4000rpm离心10min收集菌体，然后用适量PBS洗涤2次；超声破碎加适量Bindingbuffer重悬菌液，在冰水混合物中超声破碎（30w，每次3s，停5s，45min），至悬液澄清。超声后静置10min，13000rpm离心1h，收集上清，-80℃保存。SDS凝胶电泳制胶板按表2-6和表2-7配12%的分离胶和5%浓缩胶[11]

表2-612%分离胶配料表（10mL）试剂体积（mL）纯水30%丙烯酰胺1.5MTris-HCl（PH8.8）10%SDS10%APTEMED4.03.32.50.10.10.01表2-75%浓缩胶配料表（3mL）试剂体积（mL）纯水30%丙烯酰胺1.0MTris-HCl（PH6.8）10%SDS10%APTEMED2.10.50.380.030.030.003样品处理将离心后的蛋白样品和5×SDSLoadingbuffer按比例混匀，于100℃金属浴煮样(不用盖)，10min。上样与电泳每个孔蛋白质20μg，最右侧加入5μLMarker，取煮沸后的蛋白样品，用移液枪滴加变性后的蛋白样品到凝胶孔，盖上泳槽盖（插头对应孔的颜色），打开电泳电源，电压70V，跑浓缩胶25分钟，然后改变电压为120V，跑胶80分钟，电泳后用考马斯亮蓝染色30分钟，用纯水脱色直至胶的背景颜色变得干净，观察蛋白条带并拍照记录目的蛋白表达情况，根据条带颜色的深浅筛选出目的菌株，对筛选的菌株-80°甘油保存。纯化rhGH蛋白利用BIO-RADLP层析系统及GSTrapFF1mL亲和层析柱进行目的蛋白的分离纯化[12]，具体操作步骤如下：取出筛选的菌株解冻，取1mL菌液并加入50mL的LB液体培养基（含氨苄青霉素100mg/L）置于37℃恒温培养箱中以200rpm/min振荡复性12小时。复性后继续把50mL的菌液用含氨苄青霉素100mg/L的LB液体培养基扩培至500mL体系，在37℃，200rpm/min的条件下振荡培养至OD600=0.5后加入工作浓度为0.1mmol/L的IPTG，在25℃、200rpm/min的条件下振荡培养16小时，收集菌体。根据菌体重量加入超声缓冲液后进行超声破碎；对破碎后的菌液进行离心，离心机参数设置为10000rpm/min，4℃，20分钟，离心完成后将上清转移至洁净的EP管中；打开层析仪和电脑的开关，连接好层析仪的管道；从4℃冰箱中取出GSTrapFF1mL亲和层析柱，然后取下底部的塞子使蛋白纯化柱中的20%乙醇滴净(20%乙醇用于保存纯化柱中的填料)；先加入0.5MNaOH清洗管路，然后用超纯水清洗管路，接上GSTrapFF1mL亲和层析柱，继续用超纯水冲洗；以1mL/min的流速利用PBS平衡柱子后，按照0.5mL/min的速度上样，同时收集穿透液；上样后，用PBS以1mL/min的速度洗柱，直至流出液无物质；用洗脱液以1mL/min的速度洗脱，收集洗脱液；等到洗脱后用超纯水洗柱，再用20%乙醇冲洗，最后在纯化柱中加入足量的20%乙醇以保护填料，再放回4℃冰箱中；对纯化前后蛋白样品作SDS电泳。优化rhGH蛋白的表达条件将上述纯化后的菌种按1：1000比例接种于５ｍL含氨苄青霉素100mg/L的LB液体培养基中，置37℃180r/min振荡培养过夜，按1：100比例接种至新鲜上述液体LB培养基，150r/min振荡培养至OD600=0.5左右时，按以下各方式诱导表达菌株[13]：在25℃条件下，分别向培养液中添加为0.1mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、1.0mM的IPTG并诱导表达，6小时后分别取2mL样品。，在不同温度梯度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下向培养液中加入终浓度为0.25mM的IPTG，并持续诱导表达6小时，最终采取2mL样品。在25℃下诱导表达，向培养液中加入终浓度为0.25mM的IPTG，分别于4h、6h、8h、10h、12h取2mL样品。对以上样品的处理方法：于12000r/min离心后收集菌体，进行洗涤、裂解以及煮沸等处理后，使用SDS电泳分析，来确定最佳的诱导条件，再以确定的优化条件培养纯化菌株，分别取条件优化前后菌株经SDS电泳验证。鉴定rhGH蛋白电泳根据表2-6和表2-7配制12%的分离胶和5%的浓缩胶。样品前处理对蛋白样品进行研磨，并添加适量的细胞裂解液。将裂解后的蛋白样品离心，转速为12000rpm，20min后取上清液，使用BCA蛋白定量试剂盒定量，按照蛋白量及所需蛋白浓度计算出匀浆液和buffer的含量，制成上样buffer，放进锅中煮沸10min（不需要盖盖），冷却后待用。BCA蛋白定量利用该试剂盒作吸光度与蛋白浓度标准曲线。首先确定检测的样品量加8个标样（一般多配一个孔），并配制合适的BCA工作液（A液：B液=50：1，充分混合均匀），现配先用；将标准品按照0μl，1μl，2μl，4μl，8μl，16μl，20μl加到96孔板的标准品孔中，加纯水把每个孔补足到20μl，然后加入适当体积的样品到96孔板的样品孔中，加入用于稀释标准品的溶液补足到20μl[14]；各个孔加入200μl

BCA工作液，震荡30min；测定A562，酶标仪选570nm，测定，根据绘制的标准曲线计算出蛋白的浓度。上样与电泳取煮沸后的蛋白样品，用移液枪把变性后的蛋白样品滴加到凝胶孔里，盖上泳槽盖（插头与孔颜色相对应），打开电泳电源，电压60-70V，电泳时间25min，待蛋白样品溴酚蓝跑成一条直线时，电压换至120V，当跑至底端附近（绿色边以下）即可停止电泳。考马斯亮蓝染色将胶取下，用考马斯亮蓝染色40min，脱色三次，20min/次。免疫印迹试验（WesternBlotting）同电泳（一）前三个步骤转膜与封闭可用刮板将胶从边缝掀起拨掉，参照Marker分子量区域部分切除浓缩胶和多余一部分的分离胶，仅保留目的蛋白表达区。将PVDF膜事先浸洗1-2分钟的甲醇中，然后将膜与胶片和滤纸等堆叠，来进行转膜，电压为60V，时间持续1小时；转膜完毕后，当心拿下膜，加入适量的脱脂奶粉（5%）浸泡，室内温度下密封振荡2小时，封闭结束后，用TBST振荡洗膜1min。一抗、二抗孵育加入一抗（兔抗体，1:3000稀释）37℃振荡孵育1h，用PBST（20mmol/L

PBS，0.1%

Tween20）漂洗三次；之后直接加入1:5000稀释后的羊抗兔的辣根过氧化物酶标记二抗，移至37℃下振荡孵育1小时，孵育结束后再对其三次PBST漂洗。发光显影用ECL发光液400μl在暗房里，孵育膜约2-3分钟后将富士感光胶片加入，对其进行2分钟压片，然后再用显影剂显影40秒，定影1分钟。ELISA检测抗原包被以100μL/孔将包被的rhGH抗原（2μg/mL）加到酶标板中，并在4℃的电冰箱中储放一晚。洗板将抗原板内的包被液倒掉，甩干，用排枪加入洗涤液，150μL/孔，再倒掉，洗涤三次，最后一次将板内的洗涤液在书本上拍干。封闭往酶标板孔内加入5%的脱脂牛奶（用包被液配制），150μg/孔，室温中静置1h，用PBS洗三次。加一抗一抗稀释2000倍，用PBS稀释。设置三个对照组，分别是一照对抗、二照对抗、抗原对照，除了二抗对照，抗原对照加100μL的PBS外，每孔都加入100μL的一抗，室温下静置2h，洗涤3次。加二抗选用PBS加蛋白将二抗稀释5000倍。除了一抗对照和抗原对照加100μLPBS外，每个孔洞都再添加了100μL的二抗溶液，室温孔内作用40-60min，洗涤5次。显色反应加入新配制的底物溶液100μL/孔，避光作用2-3min。终止反应每个孔中加入50μL的2mol/LH2SO4溶液，在450nm波长下立刻直接用酶标仪测吸光度（OD值）。实验结果rhGH表达载体的构建及鉴定将GST-hGH质粒在BL21(DE3)感受态细胞转化后涂布于的LB固体培养基（含氨苄青霉素100mg/L）培养一晚，挑选5个单克隆菌落对其核酸电泳检验，挑取的5个菌株在750bp处均有明显的单一条带，且条带位置对应的大小均与预期相符（见图3-1），初步证实了GST-hGH重组质粒成功转化BL21(DE3)感受态细胞(Tf16分子伴侣)。在PCR扩增与琼脂糖凝胶电泳验证成功后对菌株在37℃条件下进行诱导表达，经离心收集菌体并破碎后对全菌样品做SDS电泳鉴定，与Pcold空载菌相比，5个菌株均在44kDa处有与rhGH蛋白大小一致的条带，进一步证实了rhGH蛋白在BL21(DE3)感受态细胞(Tf16分子伴侣)中成功表达。图3-1rhGH菌株PCR鉴定M:Marker（DL2000）；1~5：转化挑取的5个单克隆菌落rhGH菌株的可溶性表达验证16℃低温诱导表达样品SDS电泳结果，与Pcold空载菌相比，5个菌株的上清与沉淀样品均在44kDa处有与rhGH蛋白大小一致的条带，成功验证了重组菌株的可溶性表达。比较5个菌株目的蛋白条带颜色的深浅可知，在同样的诱导表达条件下，2号菌株的目的蛋白的表达量最高，因此选择2号菌株作为后续探究rhGH蛋白的最佳表达条件的实验菌株。rhGH蛋白的纯化将得到的菌液经GSTrapFF1mL亲和层析柱纯化，对纯化前后rhGH蛋白的沉淀与上清进行电泳，可以看到目的蛋白条带变得更明显了（见图3-2）。图3-2rhGH纯化结果rhGH表达的条件优化经SDS电泳分析，2号菌株分别在IPTG工作浓度为0.5mmol/L、温度为25℃及诱导表达时间为10h时，目的蛋白的表达量最高，以优化条件培养纯化菌株，对优化条件培养前后的菌株作SDS电泳，从结果来说，可以明显地看出优化后蛋白表达量更高（见图3-3）。图3-3rhGH表达条件优化结果rhGH蛋白的鉴定BCA蛋白定量：将超声后样品上样10μg所测OD值带入标准曲线（见图3-4），经处理后可得：上清：1.91μg/μL，沉淀：3.77μg/μL；图3-4吸光度-蛋白含量标准曲线图电泳结果：电泳检验的结果显示，在44.3kDa左右出现很明显条带，可以证明顺利获得了目的蛋白（见图3-5）。图3-5rhGH蛋白的电泳图WesternblottingGAPDH的显影胶图在34kDa附近出现清晰条带，rhGH的显影胶图在43kDa附近出现清晰条带，说明制备的rhGH可以和GH抗体特异性结合，rhGH有生物活性（见图3-6）。图3-6WB显影胶图ELISArhGH与单抗具有反应性，且反应性较强（见图3-7）。图3-7ELISA（rhGH）

讨论原核表达系统表达重组蛋白的方式可分为可溶性表达和非可溶性表达，可溶性表达的重组蛋白产物可溶于菌体破碎后的上清溶液中，而非可溶性表达的重组蛋白则以包涵体的形式存在[15]，但后期要从包涵体中纯化出重组蛋白这个过程会大大降低重组蛋白的生物活性，因此想要制备出高活性的重组蛋白，往往需要通过原核表达系统可溶性表达。Tf16分子伴侣则可协助目的蛋白在重组菌株中正确折叠，提高高活性蛋白的表达量，在此作用下成功实现了rhGH的可溶性表达。但低温条件下菌体的生长缓慢，不利于重组蛋白的表达。为了解决这个问题，本研究采用了Pcold表达载体和Tf16分子伴侣相结合的方式，在低温条件下用IPTG和L-阿拉伯糖共同诱导原核表达载体可溶性表达hGH重组蛋白。对转化的菌株进行结构鉴定初步证实rhGH蛋白在BL21(DE3)感受态细胞(Tf16分子伴侣)中成功表达，以确保实验的准确度；然后对5个单菌落低温诱导表达样品进行SDS验证，筛选表达量最高的菌株进行后续实验为了使实验结果更直观表现；为了尽可能的得到纯化rhGH为后续实验所用，使用GSTrapFF1mL亲和层析柱进行纯化，得到了较为明显的纯化结果；对于诱导条件优化考虑，高浓度的IPTG对菌体具有毒性作用，低温条件下菌体的生长缓慢，均不利于重组蛋白的表达，因此在后续研究中又对重组菌株的诱导条件进行了优化，通过电泳结果的比较得到了诱导的最佳IPTG浓度、温度和诱导时间，但由于时间缘故，是从查阅的文献作为参考直接设置的各条件梯度，故梯度设置的合理性以及得到的实验结论仍有继续探索的余地。

结论与展望本实验选用rhGH质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）的感受态细胞中，随后在低温状态下促使表达目的蛋白。通过PCR鉴定和琼脂糖凝胶电泳初步验证了GST-hGH重组质粒转化成功，SDS电泳初步验证rhGH的可溶性表达；以GSTrapFF