HPLC法测定硝呋太尔制霉菌素软胶囊中制霉菌素含量的方法研究

HPLC法测定硝呋太尔制霉菌素软胶囊中制霉菌素含量的方法研究【摘要】目的：建立测定硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊中制霉菌素含量的HPLC法。方法：采用振荡加低温超声的方式对硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊内容物进行提取。采用HPLC法测定其中制霉菌素的含量。色谱条件：色谱柱为ECOSILC18(4.6*250mm，5μm)，流动相A溶液为0.38%乙酸铵溶液-乙腈（71：29），流动相B溶液为0.38%乙酸铵溶液-乙腈（40：60），线性梯度洗脱；流速1.5mL/min；柱温控制为35℃；检测器为紫外检测器，检测波长为305nm，进样量为10μL，运行时间约70min。结果：硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊中制霉菌素含量测定方法的专属性好，辅料空白对主成分无干扰影响；重复性较好；中间精密度较好；制霉菌素浓度在0.04mg/mL~1.0mg/mL范围内线性关系良好；另外，回收率93.02%~97.49%，相对标准偏差1.74%，均符合要求。结论：硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊中制霉菌素含量测定的高效液相色谱法，方法可行，可为硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊的质量控制提供更方便准确的检测方法。【关键词】硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊；制霉菌素；高效液相色谱法；含量测定

StudyonthemethodofdeterminationofnystatincontentinnifurtelnystatinsoftcapsulesbyHPLCmethod[Abstract]Objective:ToestablishanHPLCmethodforthedeterminationofnystatincontentinnifurterolnystatinvaginalsoftgels.Methods:Thecontentsofnifurterylnystatinvaginalsoftgelswereextractedbyshakingandcryoultrasound.ThecontentofnystatinwasdeterminedbyHPLCmethod.Chromatographicconditions:thecolumnwasECOSILC18(4.6*250mm,5μm),mobilephaseAsolutionwas0.38%ammoniumacetatesolution-acetonitrile(71:29),mobilephaseBsolutionwas0.38%ammoniumacetatesolution-acetonitrile(40:60),lineargradientelution;Flowrate1.5mL/min;Thecolumntemperatureiscontrolledto35℃;Thedetectorisanultravioletdetectorwithadetectionwavelengthof305nm,aninjectionvolumeof10μL,andarunningtimeofabout70minutes.Results:Thedeterminationmethodofnystatincontentinnifurtelnystatinvaginalsoftgelshasgoodspecificity,andtheblankofauxiliarymaterialshasnointerferenceeffectonthemaincomponents;Goodrepeatability;Theintermediateprecisionisbetter;Theconcentrationofnystatinhadagoodlinearrelationshipintherangeof0.04mg/mL~1.0mg/mL.Therecoveryrateofthismethodwas93.02%~97.49%,andtherelativestandarddeviationwas1.74%,allofwhichmettherequirements.Conclusion:Thehighperformanceliquidchromatographymethodforthedeterminationofnystatincontentinnifurterylnystatinvaginalsoftgelsisfeasible,whichcanprovideamoreconvenientandaccuratedetectionmethodforthequalitycontrolofniturterylnystatinvaginalsoftgels.[Keywords]NifurterolnystatinvaginalsoftgelsNystatinHighperformanceliquidchromatographyContentdetermination

目录TOC\o"1-3"\h\u1文献综述 文献综述研究的目的与意义抗生素自20世纪40年代被发现以来，被广泛用于预防和治疗疾病，因为它们具有有效的抑菌和杀菌作用，可以迅速解决由细菌感染引起的疾病。然而，在现实生活中，抗生素的不规范使用会导致抗生素的滥用，从而导致危害人类健康的问题，例如耐药性。后政府出台了一系列管控抗生素使用的政策。因此，建立一个高效、准确的检测方法很有必要，以保证抗生素的正确合理使用和抗生素类药品的安全生产。当下妇科相关疾病广受重视，而阴道炎是一种易引起患者多种不适症状的常见妇科疾病，其中硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊是针对阴道炎治疗的有效制剂REF_Ref29389\r\h[1]。目前中国药典、欧洲药典、美国药典等均有收载制霉菌素及其相关剂型的质量标准，但硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊作为较新剂型，上述药典中均没有针对该剂型中制霉菌素含量测定的具体方法。硝呋太尔制霉菌素软胶囊作为多组分药物制剂，建立一种切实可行的检测方法对其制霉菌素含量进行监控，对提高产品质量具有重大意义。制霉菌素的概述制霉菌素的结构与性质制霉菌素（nystatin），分子式为C47H75O17，具有共轭多烯大环内酯结构，其结构式见图1。图1制霉菌素结构式作为人类发现第一种抗霉菌的抗生素，最早被发现于土壤微生物Streptomycesnoursei分泌的物质中REF_Ref29611\r\h[2]。制霉菌素对真菌类微生物的生长有一定的抑制作用。制霉菌素利用真菌细胞膜的固醇形成孔道，增加其通透性，促进渗出胞内的重要物质，使真菌死亡。基于这个原理，我们发现制霉菌素不具有抗细菌的能力，因为缺少增加通透性的重要物质固醇REF_Ref29699\r\h[3]。因此制霉菌素临床上通常用于皮肤、口腔念珠菌感染的外用治疗REF_Ref29764\r\h[4]。制霉菌素通常是一种多组分混合物，其中可能包含制霉菌素A1、A2、A3和其他成分REF_Ref29904\r\h[5]REF_Ref29908\r\h[6]，是Hazen、Brown在1959年时首次分离成功。后来，蔡润生等人采用从土壤中分离、发酵的方法，获得了国内生产的制霉菌素。据相关资料显示，国产制霉菌素无论是成分的组成、生物效价等都与国外的有一定的不同，因此后改名为制霉素，以区分制霉菌素REF_Ref29976\r\h[7]REF_Ref29980\r\h[8]。硝呋太尔与制霉菌素硝呋太尔(nifurate1)REF_Ref30051\r\h[9]是由意大利普利化学工业公司独家研发生产的新药，专门为妇科疾病中混合性感染的治疗所研制REF_Ref30156\r\h[10]。硝呋太尔属于广谱抗微生物的药物，为硝基呋喃类衍生物，对女性生殖系统中的滴虫、白念珠菌等常见的致病菌都有很好的抑制作用。制霉菌素与硝呋太尔联合制成的剂型有阴道栓、阴道软膏、阴道软胶囊。其中，由于软胶囊制剂剂型的安全稳定方便等优势，近年来在临床中的运用频率显著提升。在妇科阴道炎疾病中运用硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊可取得良好成效，相关研究显示，滴虫性、霉菌性、细菌性阴道炎临床治疗总有效率均达到了90%以上，此外患者在此药物使用过程中有着相对较低的不良反应发生率REF_Ref30238\r\h[11]。在临床应用中，相关治疗都是硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊多与其他药物配合，加速疗效。如与奥硝唑栓联合使用，临床上治疗效果良好，尤其是滴虫性阴道炎，并可减轻微炎性反应状态，不良反应少，复发率低，安全性高REF_Ref30394\r\h[12]REF_Ref30398\r\h[13]。与伊曲康唑配合治疗，可以提高念珠菌性阴道炎临床疗效，减少相关疾病的复发率REF_Ref30469\r\h[14]。与红核妇洁洗液搭配，治疗外阴阴道假丝酵母菌病，即降低了副作用的反应，又加速疗效，对临床上参考价值极高REF_Ref30528\r\h[15]。抗生素类药品含量检测方法研究在现有研究中，有很多检测抗生素药品含量的方法，如微生物检定法、紫外-可见光分光光度法和高效液相色谱法等。确定抗生素有效性的最常见方法是微生物检定，是运用最为广泛的方法。经过多年的监测，发现该方法操作上难度不低、稳定性差、结果误差大，但是，历年来依旧起着重要作用，主要是微生物验证的直观性优点，因此在生物发酵所得的多组分抗生素类药物的测定，多选择微生物检定法REF_Ref30610\r\h[16]。紫外-可见光分光光度法，与微生物鉴定不同，它在操作上难度极低、灵敏度高，但也由于此原因，满足不了抗生素类药物的复杂组分和不稳定的活性成分比例，因此在抗生素类药品的含量测定中紫外-可见光分光光度法使用较少REF_Ref30678\r\h[17]。高效液相色谱法(HPLC法)分离效果好，使用率高，不仅可以分离样品中的成分，还可以准确测量各组分的峰面积峰高等具体数据来计算检测物质的含量，其方法已广泛运用于各种制药或生物医学分析工作，是有机物质定量分析的主要分析工具REF_Ref30734\r\h[18]。除了以上三种常见方法外，还有重量分析法、酸碱滴定法、碘量法等可用于抗生素类药品的含量测定工作REF_Ref30776\r\h[19]。制霉菌素含量测定方法研究各国药典中制霉菌素现行检测方法研究参考国内多个制霉菌素有关制剂所用标准，多采用效价测定与制霉菌素组分测定结合作为制霉菌素含量数据依据。其中，制霉菌素组分测定照高效液相色谱法，采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂，0.38%乙酸铵溶液和乙腈按体积比29：71配制为流动相A溶液，0.38%乙酸铵溶液和乙腈按体积比40：60配制为流动相B溶液，柱温设定为30℃，检测波长为305nm，再以线性梯度洗脱70min，测得相关色谱图信息。后按峰面积归一化法计算样品中制霉菌素A1比例，结合效价测定结果得出制霉菌素含量。制霉菌素的含量测定在英国药典、美国药典和日本药典中均有收载记录。在英国药典中，对制霉菌素采用高效液相色谱法的方法进行含量测定，其中，采用十八烷基硅烷键合硅胶作为固定相，溶剂为二甲基亚砜，流动相A与流动相B的配制和中国药典相同，柱温30℃，检测波长305nm，再以线性梯度洗脱50min，测得相关色谱图信息。后按峰面积归一化法计算样品中制霉菌素A1比例，结合效价测定结果计算制霉菌素含量。在美国药典中，与英国药典检测方式几近相似，但检测波长为304nm。在日本药典中，采用抗生素微生物检定法进行测定制剂中制霉菌素含量。上述药典中，检测制霉菌素含量虽有使用HPLC法，但仅用测得色谱图计算制霉菌素A1的比例，制霉菌素含量仍需结合微生物检测结果进行计算。制剂中制霉菌素含量测定方法研究目前市面上有较多制霉菌素相关药物制剂，部分剂型的药品质量标准中制定了制霉菌素含量检测方法。黄嵩等人REF_Ref30848\r\h[20]针对制霉菌素混悬剂制定了测定其制霉菌素含量的HPLC法，色谱条件中同样采用C18色谱柱，305nm检测，10μL进样，但其根据剂型因素流动相更改为甲醇-N,N-二甲基甲酰胺-0.1M醋酸铵溶液（550：150：270）；后选效价测定法即制霉菌素的公认含量测定法，以管碟法测量抑菌圈直径衡量抑菌效果为观察目标，对其结果比对，得出结论，所建立的HPLC法符合要求，更值得点出的是，其方法省时省力、操作简单。王婷等人REF_Ref30904\r\h[21]针对制霉菌素空腔糊剂制定了测定其制霉菌素含量的紫外分光光度法，以二甲亚砜为溶剂，在309nm处测定制霉菌素波长，该法在10~200U/mL范围内线性关系良好。高远等人REF_Ref30966\r\h[22]针对制霉菌素甘油制剂制定了测定其制霉菌素含量的紫外分光光度法，以甲醇为溶剂，在304nm处测定吸光度A值，该法方便快速，重复性较好。唐锦心等人REF_Ref31015\r\h[23]针对制霉菌素口腔双层贴膜剂型制定测定其制霉菌素含量的紫外分光光度法，同样以甲醇为溶剂，在304nm处测定吸光度A值，制霉菌素在1.02～20.40μg/mL内呈良好的线性关系。高章圈等人REF_Ref31057\r\h[24]针对制霉菌素膜剂制定测定其制霉菌素含量的分光光度法，同样以甲醇为溶剂，但更改为在291nm处测定吸光度A值。蔡果REF_Ref31100\r\h[25]针对制霉菌素栓制定测定其制霉菌素含量的紫外分光光度法，同样以甲醇作为溶剂，对其进行检测，其检测波长304nm，与吸光度之间至少在19.912~99.56mg/L的浓度范围内是良好的线性关系，其平均回收率达到了99.38%，RSD为1.50%。虽各国药典中主要记载以微生物检定法测定制霉菌素的含量，随着制药工艺的进步，所制的制霉菌素中制霉菌素A1纯度越来越高，随后多建立以紫外分光光度法为主的便捷准确的测定方法。但随着近年来高效液相色谱法的推广及普及，人们开始尝试使用HPLC法测定制剂中制霉菌素的含量。研究内容本研究旨在建立一种以制霉菌素标准品为对照，使用外标法测定硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊中制霉菌素含量的高效液相色谱法，在研究探讨以往的相关参考文献后，优化了对样品提取方法、色谱条件等，从而建立一种高效、简便的制霉菌素含量测定HPLC法，为硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊中制霉菌素的测定奠定基础。

材料与方法试剂表2-1试剂试剂名称生产厂家生产批号甲醇（色谱纯）LiChrosolvI1204107213氢氧化钠MACKLINC13060726氯化氢广州牌化学试剂2020070930%过氧化氢广州牌化学试剂20201202N,N-二甲基甲酰胺（色谱纯）福晨化学20191030乙腈（色谱纯）LiChrosolvJB127130乙酰胺(分析纯）广州牌化学试剂20171102制霉菌素标准品中国药生物制品检定研究所201802制霉菌素样品/201501制霉菌素样品/201601制霉菌素样品/201602仪器表2-2仪器仪器名称生产厂家型号稳定性实验箱天津药典标准仪器厂WD-1恒温水浴摇床ChomtronSW22荧光检测灯CAMAGUV-CABINETⅡ超纯水发生器MILLIPOREMiliQReference电子天平（1/十万）SARTORIUSCP225D高效液相色谱仪Agilent1200Series/G1311A四元泵高效液相色谱仪Agilent1260ALS/G1311C高效液相色谱仪WATERSE2495/四元泵色谱柱ECOSILC185μm4.6*250mm色谱柱XtimateC185μm4.6*250mm色谱柱GLSciencesC185μm4.6*250mm涡流混合器JOANLAB1220超声波清洗器BRANSONICN8800H-C方法色谱条件色谱柱ECOSILC18(4.6*250mm，5μm)，流动相A溶液为0.38%乙酸铵溶液-乙腈（71：29），流动相B溶液为0.38%乙酸铵溶液-乙腈（40：60）；柱温控制为35℃；检测器为紫外检测器，检测波长为305nm，进样量为10μL，流速为1.5mL/min，线性梯度洗脱。表2-3梯度洗脱时间（min)流动相A（%）流动相B（%）01000351000500100600100651000701000溶液的制备2.3.2.1流动相的制备称取3.8g的乙酸铵，加入1L的超纯水，搅拌均匀，后将超声5~10min使其完全溶解，即为0.38%乙酸铵溶液。取710mL0.38%乙酸铵溶液，加入290mL乙腈，配制为流动相A溶液。取400mL0.38%乙酸铵溶液，加入600mL乙腈，配制为流动相B溶液。2.3.2.2制霉菌素标准品溶液的制备取10mg制霉菌素标准品，精密称定，置于25mL量瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺配制成0.4mg/mL的制霉菌素标准品溶液。2.3.2.3供试品溶液的制备精密称取硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊中内容物0.86g于三角烧瓶中，加入约25mL的N,N-二甲基甲酰胺，封口后采用振摇仪器振摇15min至样品基本溶解，后采用低温超声的方式使其完全溶解，大约超声5min；溶解后将溶解液转移至50mL量瓶中，使用约20mLN,N-二甲基甲酰胺分3~4次洗涤三角烧瓶内部，洗涤液合并入量瓶中，再加N,N-二甲基甲酰胺至量瓶刻度，摇匀，过滤，取续滤液即为含有制霉菌素约0.4mg/mL的供试品溶液。

方法学验证系统适用性试验取制霉菌素标准品约10mg于25mL量瓶中，加入12.5mL甲醇，振摇至其完全溶解，再加水稀释至量瓶刻度；取此溶液5mL，加入1mL稀盐酸，混匀，置于室温下20min后，取10μL注入高效液相色谱仪，根据2.3.1色谱条件将色谱图记录完整，进行图谱分析，14min~35min内的两主峰分离度应不小于3.5。线性关系考察共配制了6个系列浓度，取制霉菌素标准品5mg，精密称定，置于5mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液①；取一个5mL量瓶，精密量取①4mL加入量瓶，用N,N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，作为对照品溶液②；精密量取②2.5mL于5mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，作为对照品溶液③；精密量取③2.5mL于5mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，作为对照品溶液④；精密量取④2.5mL于5mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，作为对照品溶液⑤；精密量取⑤2mL于5mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，作为对照品溶液⑥；以上6份对照品溶液浓度分别为1.0mg/mL，0.8mg/mL，0.4mg/mL，0.2mg/mL，0.1mg/mL，0.04mg/mL，分别进样10μL，根据2.3.1色谱条件，记录以上6份溶液的色谱图及峰面积。其中，以制霉菌素峰面积（A）对标准品溶液的质量浓度（c）制作线性回归曲线，分析A与c的线性关系。稳定性试验取供试品（批号为210602）按上述供试品溶液方法制备，在10℃环境放置0min，70min，140min，210min，280min，350min，分别进样10μL，根据2.3.1色谱条件将色谱图完善记录，以制霉菌素峰面积为观察对象考察溶液变化情况。取供试品（批号为210602）按上述供试品溶液方法制备，在室温环境下放置0min，70min，140min，210min，280min，350min，分别进样10μL，按照2.3.1色谱条件进行分析，记录各份供试品溶液的色谱图，根据测得的色谱图中制霉菌素峰面积考察溶液变化情况。重复性试验平行称取6份供试品（批号：210501），按照上述方式配制，每份溶液连续进样2次，每次进样10μL，同样以2.3.1色谱条件为根据，记录色谱图，以制霉菌素峰面积与溶液浓度计算重复性RSD%。中间精密度试验为了确定所用仪器在相同色谱条件下多次测定结果的重现性，试验选用了高效液相色谱仪Agilent（1200Series/G1311A四元泵）+色谱柱GLSciencesC18(4.6*250mm,5μm)、高效液相色谱仪Agilent（1260ALS/G1311C）+色谱柱XtimateC18(4.6*250mm,5μm)、③高效液相色谱仪Agilent（1200Series/G1311A四元泵）+色谱柱ECOSILC18(4.6*250mm,5μm)，对供试品进行深入考察。量取供试品溶液（批号：210501）和标准品溶液各两份，均取适量溶液注入以上三台高效液相色谱仪，每份溶液进样2次，每次进样10μL，根据2.3.1色谱条件进行实验分析，并记录色谱图，计算测定的样品中制霉菌素含量的相对标准偏差。专属性试验①专属性标准品溶液的制备：取2mg制霉菌素标准品，精密称定，置于5mL量瓶中，加入2.5mg甲醇溶解，再加水至量瓶刻度线，摇匀制得含有制霉菌素标准品0.4mg/mL的溶液，作为专属性标准品溶液。②空白对照溶液的制备：取一干净的5mL量瓶，精密称取0.86mg空白辅料置于量瓶中，加入2.5mL甲醇溶解完全，再加水至刻度，摇匀后滤过，取续滤液作为空白对照溶液。③阴性对照溶液的制备：精密量取2mL空白对照溶液，加入0.4mL的稀盐酸，室温放置20min以上，即为阴性对照溶液。④酸性条件破坏溶液的制备：取1mL专属性标准品溶液，加入稀盐酸，作为酸性条件破坏溶液。⑤碱性条件破坏溶液的制备：在1mL专属性标准品溶液中加入0.2mLNaOH溶液，于室温条件下放置30min，作为碱性条件破坏溶液。⑥高温条件破坏溶液的制备：取1mL专属性标准品溶液，在60℃条件下放置30min，作为高温条件破坏溶液。⑦紫外条件破坏溶液的制备：取1mL专属性标准品溶液，放置在紫外254nm的条件下，时间为18h，将其作为紫外条件破坏溶液。⑧光照条件破坏溶液的制备：取1mL专属性标准品溶液，自然光照条件下放置18h，作为光照条件破坏溶液。⑨氧化条件破坏溶液的制备：取1mL专属性标准品溶液，后向其加入0.2mL3%H2O2溶液，室温环境中放置90min，作为氧化条件破坏溶液。上述9份不同破坏条件的溶液依次进样，以2.3.1色谱条件为基础进行进行分析研究，记录色谱图，观察不同破坏条件下色谱图中制霉菌素峰的变化。回收率实验精密称取制霉菌素标准品100mg于10mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺配制成10mg/mL的制霉菌素标准品溶液。精密称取6份硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊（批号：210501）中内容物0.43g于三角烧瓶中，精密量取1mL的10mg/mL的制霉菌素标准品溶液加入每份样品，封口后采用振摇仪器振摇15min至样品几乎溶解，后超声5min使其溶解完全；溶解后溶液转移至50mL量瓶中，约20mLN,N-二甲基甲酰胺分三次洗涤三角烧瓶内部，后将洗涤液合并入量瓶中，再加N,N-二甲基甲酰胺至刻度，配置成含有制霉菌素约0.4mg/mL的加标回收溶液。以上6份加标回收溶液按顺序进样，并以2.3.1色谱条件为基础进一步分析研究，记录色谱图，计算投入量与测得量的回收率。

结果与分析系统适用性试验结果试验结果见图2。在18min-24min内两主峰分离度为3.5，方法的分离度较好。图2制霉菌素含量测定系统适用性图线性关系考察结果标准曲线如图4-2所示，以制霉菌素标准品浓度（mg/mL）作为横坐标，制霉菌素峰面积作为纵坐标，用最小二乘法的方式对A和c做线性回归，制霉菌素峰面积与标准品浓度两者之间呈线性关系，其回归方程为y=19291397.2177x-50006.8222，相关系数为R2=1.0000，以上数据表明制霉菌素在0.04~1.0mg/mL浓度范围内线性关系良好。图4-2制霉菌素标准品线性关系图稳定性试验结果试验结果如表4-3-1和表4-3-2所示，硝呋太尔制霉菌素软胶囊内容物中制霉菌素供试品溶液在低温下放置6h内和在室温下放置6h内峰面积均未发生明显变化，制霉菌素在N,N-二甲基甲酰胺溶解的溶液情况下较稳定，RSD均小于2.0%，表明制霉菌素供试品溶液稳定性良好。表4-3-1供试品溶液在低温条件下的稳定性时间（min）峰面积RSD(%)089962340.397090901801409030866210908141028090689383509039507表4-3-2供试品溶液在室温条件下的稳定性时间（min）峰面积RSD(%)089307861.047087932411408739659210879541428086978153508677731重复性试验结果重复性结果如表4-4所示，供试品（批号：210501）中制霉菌素含量在125.64%~132.18%之间，平均含量为128.82%，相对标准偏差为1.89%，符合《中国药典》中的规定。表4-4重复性试验结果序号取样量（g）含量%含量RSD%10.8435127.911.8920.8484127.6230.8938128.3240.8675131.2250.8735132.1860.8599125.64中间精密度试验结果中间精密度结果如表4-5所示，在采用了相同的色谱条件和相同色谱柱型号的情况下，将同一批样品放置在有仪器差异的高效液相色谱仪和色谱柱中进行制霉菌素的含量测量，测得样品中制霉菌素的平均含量分别为129.28%、128.58%、126.71%，相对标准偏差为1.03%，遵循了《中国药典》中的规定。表4-5中间精密度实验结果序号平均含量%平均含量RSD%①129.281.03②128.58③126.71专属性试验结果专属性结果见图3-图11。图3专属性标准品溶液色谱图图4空白对照溶液色谱图图5阴性对照溶液色谱图图6酸性条件破坏溶液色谱图图7碱性条件破坏溶液色谱图图8高温条件破坏溶液色谱图图9紫外条件破坏溶液色谱图图10光照条件破坏溶液色谱图图11氧化条件破坏溶液色谱图具体试验结果表明，本次样品制剂中的辅料和实验所用的溶剂对制霉菌素的含量测定均无干扰，本研究设定的色谱条件下，制霉菌素在不同临界条件下能较好地分离制霉菌素分解产物及其他未知杂质，所以方法专属性良好。回收率试验结果在拟定方法下测定的制霉菌素的回收率在93.02%~97.49%之间，平均回收浓度为95.46%，相对标准偏差为1.74%，符合《中国药典》中的规定。表4-7加标回收率结果样品称重（g）样品中制霉菌素（mg）标准品加入量（mg)检出量（mg）回收率%平均回收率%回收率RSD%0.433312.879.6121.7596.7695.461.740.444313.2022.2497.490.439713.0621.6395.420.413412.2820.6094.120.423012.5720.6393.020.454913.5122.1995.95方法学验证结果上述方法学验证试验结果表明，此方法可以测定硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊中的制霉菌素含量，方法可行。

样品的含量测定溶液的配制供试品溶液：精密称取批号210501，210601，210602的硝呋太尔制霉菌素软胶囊中内容物0.86g，各称取2份，按2.3.2.3方式配制成6份供试品溶液。对照品溶液：精密称取2份20mg制霉菌素标准品，分别置于2个50mL量瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺混合均匀，配制成2份0.4mg/mL的制霉菌素标准品溶液。测定方法取5.1中溶液，每份连续进样2次，每次进样10μL，根据2.3.1色谱条件进样测定，并记录每份溶液所测得的色谱图。以色谱图中数据为基础，使用外标法公式，以各批样品中制霉菌素峰面积计算其含量。测定结果实验结果见表5-1，3批硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊中的制霉菌素含量分别为127.76%、130.05%、130.94%，含量的相对标准偏差分别为0.16%、0.41%、0.40%。表5-1不同批次硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊中的制霉菌素含量名称称重(g)平均峰面积含量%平均含量%含量RSD%批号：2105010.84359282969127.91127.760.160.84849315329127.62批号：2106010.86459701700130.43130.050.410.87519763278129.67批号：2106020.84229514532131.30130.940.400.87309807407130.57讨论讨论本研究测定的制霉菌素含量并非纯物质含量，而是制剂的百分标示量，上述数据符合药典要求。因为硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊制剂中添加了较多的油性基质辅料，所以在色谱柱前添加了预柱以保护色谱柱性能。由于样品中辅料过多，且存有较多油性基质，使样品完全溶解较为困难。最初尝试超声30min使其溶解，但测试分次溶解样品的制霉菌素含量相差较大，考虑超声时间过长，会破坏样品中部分制霉菌素。后采用振摇与低温超声联合方式提取，取适量样品置于三角烧瓶中，加入最终溶解样品的一半量的溶剂，先振摇至样品基本溶解，后将其进行短暂低温超声处理，至样品完全溶解，其中内容物所含有的油状基质在溶液中呈现透明无色的油滴状态即为提取完全，再将溶解液转移至量瓶中，用溶剂少量多次得洗涤三角烧瓶，并将每次洗涤液合并入量瓶内，最终用溶剂定容并混合均匀。此操作测定可保证制霉菌素提取完全，并重复性良好。虽有转移溶解液操作的部分损失，但对测定结果影响较小。制霉菌素为多组分混合物，但本实验主要以制霉菌素中主组成成分制霉菌素A1为测定对象，测试结果与样品效价测试结果接近，本实验可为硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊中制霉菌素含量的高效液相色谱法测定提供实验数据支持。小结本研究采用较科学、合理的方法学验证了硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊中制霉菌素含量测定的高效液相色谱法，同时进行了对其系统适用性的分析研究，表明本测定方法系统适用性好，专属性强，分离度达到药典要求；制霉菌素标准品溶液在0.04mg/mL~1.0mg/mL浓度范围内线性关系良好；重复性RSD为1.89%，重复性良好；回收率为95.46%，RSD为1.74%，回收率良好。本研究制定的硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊中制霉菌素含量测定的高效液相色谱法，方法可行，可以为硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊的质量控制提供更方便准确的检测方法。

结论本研究建立了硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊中制霉菌素含量测定的高效液相色谱法，采用振荡加低温超声的方式对硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊内容物进行提取。色谱条件：色谱柱：ECOSILC18(4.6*250mm，5μm)，流动相A溶液为0.38%乙酸铵溶液-乙腈（71：29），流动相B溶液为0.38%乙酸铵溶液-乙腈（40：60），线性梯度洗脱；流速1.5mL/min；柱温控制为35℃；检测器为紫外检测器，检测波长为305nm，进样量为10μL，运行时间约70min。本实验通过了优化色谱条件，硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊中制霉菌素含量测定的专属性好，辅料空白对色谱峰保留时间无干扰影响；重复性较好；中间精密度较好；制霉菌素浓度再0.04mg/mL~1.0mg/mL范围内线性关系较好；方法的回收率为93.02%~97.49%，相对标准偏差为1.74%。硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊中制霉菌素含量测定的高效液相色谱法，方法可行，可以为硝呋太尔制霉菌素阴道软胶囊的质量控制提供更方便准确的检测方法。

参考文献陈水英.硝呋太尔制霉素阴道软胶囊治疗门诊阴道炎患者的效果[J].临床合理用药杂志,2022,15(35):112-115.DOI:10.15887/j.cnki.13-1389/r.2022.35.035.HaberL,王仕农.雷切尔·布朗和制霉菌素的发现[J].世界科学,1985(07):56+64.TahseenH.Nastil,MasoodA.Khan,M.Owais.EnhancedefficacyofPH-sensitiveNYTliposomesagainstCryptococcusneoformansinmurinemodel[J].JournalofAntimicrobialChemotherapy2006,57:349-352.SzomekM,ReinholdtP,PetersenD,etal.Directobservationofnystatinbindingtotheplasmamembraneoflivingcells[J].BiochimBiophysActaBiomembr,2021,1863(2):183528.马剑文,刘玉波,文德秀,等.高效液相色谱法研究国内外制霉菌素的组成[J].药学学报,1985,20(4):294-300.凌大奎,