不同加热时间燀制后苦杏仁中苦杏仁苷含量变化的研究

不同加热时间燀制后苦杏仁中苦杏仁苷含量变化的研究【摘要】目的：国内外对燀苦杏仁的炮制依旧停留在凭借炮制人员主观经验控制水平，缺乏标准的燀制工艺参数。为有效提高燀苦杏仁中苦杏仁苷的含量，优化燀制工艺，为燀苦杏仁燀制工艺参数的制定提供实验依据。方法：采用高效液相色谱法测定不同加热时间燀制后苦杏仁中苦杏仁苷的含量，研究不同加热时间燀制后苦杏仁中苦杏仁苷的含量变化，找出不同加热燀制时间与苦杏仁苷含量之间的内在联系。结果：实验最终通过对燀制时间对应的苦杏仁苷含量进行回归，得出曲线回归方程y=-0.067x2+0.6791x+2.466，R2=0.8605，分析可知加热燀制时间为5min时，燀制后的苦杏仁中苦杏仁苷含量最高，为最优的燀制时间。结论：不同加热时间对燀制后苦杏仁中苦杏仁苷含量变化有明显的影响。【关键词】燀苦杏仁；苦杏仁苷含量；高效液相色谱法；燀制工艺

Changesofamygdalincontentinbitteralmondsafterdifferentheatingtimeperiods[abstract]Objective:Theprocessingofbitteralmondathomeandabroadstillstaysatthecontrollevelofsubjectiveexperienceofprocessingpersonnel,andlacksofstandardprocessparameters.Inordertoeffectivelyimprovethecontentofbitteramygdalin,optimizethemanufacturingprocess,andprovideanexperimentalbasisfortheformulationofthemanufacturingprocessparameters.Methods:HPLCwasusedtodeterminethecontentofamygdalininbitteralmondsafterdifferentheatingtimes,studythecontentofamygdalininbitteralmondsafterdifferentheatingtimes,andfindtheinternalconnectionbetweendifferentheatingtimesandamygdalincontent.Results:Theexperimentfinallyregressedtheamygdalincontent,andthecurveregressionequationwasy=-0.067x2+0.6791x+2.466,R2=0.8605.Whentheheatingtimewas5min,theoptimalpreparationtime.Conclusion:Differentheatingtimeobviouslyaffectsthecontentofamygdalin.[Keywords]bitteralmondbitterysidecontenthighperformanceliquidChromatographyadventitiaprocess目录TOC\o"1-4"\h\u167431前言 前言燀苦杏仁为苦杏仁［本品为蔷薇科植物山杏PrunusarmeniacaL.var.ansuMaxim.、西伯利亚杏PrunussibiricaL.、东北杏Prunusmandshurica（Maxim.）Koehne或杏PrunusarmeniacaL.的干燥成熟种子］[]的加工炮制品。炮制方法为:取苦杏仁投入沸水中，翻动片刻，捞出；燀至种皮由皱缩至舒展、易搓去时，捞出，放入冷水中，除去种皮，晒干[]。现代研究表明，苦杏仁中含有苦杏仁苷、脂肪油、苦杏仁酶以及多种矿物元素等[]，其中苦杏仁苷结构式为苯羟基乙氰-β-D-葡萄糖-6-β-D-葡萄糖苷，苦杏仁苷最后可分解生成苯甲醛和对人体有毒害作用的氢氰酸(HCN)[]，人一旦摄入过多的氢氰酸就会引起中毒，故苦杏仁不能生食，需炮制减毒后方可食用。氢氰酸主要是由于苦杏仁苷在苦杏仁苷酶的作用下水解生成杏仁氰，杏仁氰不稳定遇热而产生。苦杏仁苷具有镇咳平喘[]、抗氧化[]等作用，而对苦杏仁进行燀制目的在于杀酶保苷[]。苦杏仁的炮制方法除燀法外，还有蒸、炒等方法。马雪松等[]采用高效液相色谱法测定苦杏仁及其炮制品中苦杏仁苷的含量，结果显示苦杏仁苷含量为：生苦杏仁（6.33%）>蒸苦杏仁(5.51%)>燀苦杏仁（3.64%）>炒苦杏仁（2.13%）。可见燀制后苦杏仁苷含量大于炒制，蒸制后苦杏仁苷含量仅次于生品，蒸制后有效成分含量相对值保存较高，但蒸制后仍需将苦杏仁种皮去掉，操作较为繁琐。《中华人民共和国药典》2020年版中苦杏仁的炮制方法只收录了炒制和燀制，其他方法对苦杏仁进行炮制后所得的苦杏仁炮制品不能大范围流通，地方标准所得的苦杏仁炮制品流通范围较狭小，原因在于地方炮制标准不一定被其他地区的营销商所认可接受，在很大程度限制了其流通区域，进而限制苦杏仁炮制饮片的销售量。对燀苦杏仁炮制工艺的优化，不仅顺应了研究趋势，也能为制定标准的苦杏仁燀制工艺参数提供理论依据和实验数据，保证了饮片质量和炮制工艺的可重复性。饮片中有效物质成分的含量可直接影响饮片的治疗效果，如果饮片中有效成分含量过低，远低于规定值，饮片质量差，那么该饮片发挥的药效也低，无法达到预期的治疗效果，加深患者对中药治疗疾病效果差的印象，进而阻碍中医药文化的发展与传承。所以优化燀苦杏仁燀制工艺，提高燀苦杏仁中苦杏仁苦杏仁苷的含量，不仅有利于提高饮片质量，而且可使患者对中医药治疗疾病效果差的印象得到改观，进而促进中医药文化的发展。由于苦杏仁苷在提高机体免疫功能、抗肝肾纤维化及抗炎镇痛等方面具有重要药理作用，使其成为研究的热点之一。尤其是如何提高苦杏仁中苦杏仁苷的含量，而通过改善炮制工艺，从而保护其药理活性成分并提高苦杏仁苷的含量，已经成为研究的重难点。目前，燀苦杏仁的炮制主要还停留在凭借炮制人员的主观经验控制水平，缺乏准确的燀制工艺参数标准。本研究通过控制燀制加热时间得到不同加热时间下的燀苦杏仁样品，采用高效液相色谱法对燀苦杏仁样品中的苦杏仁苷含量进行测定，得到不同加热时间燀制后苦杏仁中苦杏仁苷含量，最后对所得实验数据进行处理分析，得出最优的加热燀制时间，确保苦杏仁苷含量符合《中华人民共和国药典》2020年版规定，优化燀制方案，为制定标准的燀制工艺参数提供理论数据和实验依据，保证饮片质量和炮制工艺的可重复性。2仪器与材料2.1仪器材料研钵；具塞锥形瓶；玻璃杯；高效液相色谱仪Agilent120；二号筛；四元泵；三目筛；UV检测器；烧杯；柱温箱；秒表；冷凝管；自动进样器；电子天平；工作站。2.2药物与试剂苦杏仁市售品经康美药业股份有限公司质量管理部经理林润坚鉴定为蔷薇科植物东北杏Prunusmandshurica（Maxim.）的干燥成熟种子；苦杏仁苷对照品购于中国食品药品检定研究院；已腈（HPLC）购于美国基尼斯高纯化学有限公司；磷酸（HPLC）购于科密欧化学试剂有限公司；甲醇（AR）购于汕头达濠精细化学品有限公司；无水甲醇（AR）购于广东光华科技股份有限公司；甲苯购于国药集团。3实验方法3.1苦杏仁的燀制将过三目筛的净苦杏仁投入100℃的开水中，观察投入开水中的苦杏仁，燀至苦杏仁的种皮膨胀鼓起，便可用笊篱捞出，放入事先准备好的冷水中冷浸，手工除去种皮，摆放在木板上晒干即得。供试品的制备：取6份（50g/份）过三目筛的净苦杏仁投入100℃的开水中，从投入起用秒表开始计时，分别燀制2min、3min、4min、5min、6min和7min后捞出，放入事先准备的冷水中冷浸1min，除去种皮，晒干，得到6份不同燀制时间下的燀苦杏仁供试品。3.2燀苦杏仁水分测定取供试品适量，精密称定，置A瓶中，加甲苯约200ml，连接仪器，自冷凝管顶端加入甲苯至充满B管的狭细部分。将A瓶置电热套中或用其他适宜方法缓缓加热，待甲苯开始沸腾时，调节温度，使每秒馏出2滴。待水分完全馏出，即测定管刻度部分的水量不再增加时，将冷凝管内部先用甲苯冲洗，再用饱蘸甲苯的长刷或其他适宜方法，将管壁上附着的甲苯推下，继续蒸馏5分钟，放冷至室温，拆卸装置，放置使水分与甲苯完全分离。读取水分测定管内读数，并计算供试品燀苦杏仁中的含水量(%)。按《中华人民共和国药典》2020年版规定燀苦杏仁干燥品水分标准不得超过7.0%。燀苦杏仁水分计算公式：W%=V/M×100%式中：V--水分测定管内读数，ml;M--供试品重量，g；W--供试品含水量（%）。3.3苦杏仁苷的含量测定3.3.1色谱条件与系统适用性试验色谱柱：AgilentExtend-C18(250mm×4.6mm，5μm)；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1%磷酸溶液（8:92）为流动相；流速：1.0ml/min；检测波长为207nm；柱温：30℃。理论板数按苦杏仁苷峰计算应不低于7000。3.3.2对照品溶液的制备取苦杏仁苷对照品，用电子天平精密称定苦杏仁苷对照品2.0g，放入50ml容量瓶中，加甲醇制成40μg/ml的对照品溶液。3.3.3供试品溶液的制备6种供试品按以下方法制得6种供试品溶液：取少量燀苦杏仁供试品放入研钵中研成粉末，过二号筛，用电子天平精密称定粉末约0.25g，取出粉末置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率50kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置于50ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得[1]。对所得的供试品溶液进行编号，编号为样品1～6，分别对应加热燀制时间为2～7min的燀苦杏仁供试品。3.3.4测定法将对照品溶液及冷浸时间为1min,加热时间分别为2min、3min、4min、5min、6min、7min的燀苦杏仁所制得的供试品溶液（样品1～6）各10～20μl，注入高效液相色谱仪中[1]，记录对照品溶液及供试品溶液的保留时间、峰面积等相关实验数据，并计算出不同编号供试品溶液中的苦杏仁苷含量。其中供试品溶液中苦杏仁苷含量的计算公式如下：含量=×100%式中：A样--样品组分峰面积;c对--对照品浓度（μg/ml）；V--样品稀释体积（ml）；A对--对照品峰面积；m样--样品取样量(g)。根据《中华人民共和国药典》2020年版规定，苦杏仁苷含量按干燥品计算，不得少于2.4%。3.3.5方法学考察精密度试验精密吸取苦杏仁苷对照品溶液10μl，连续进样5次，计算峰面积的RSD。线性关系考察精密吸取苦杏仁苷标准溶液1、2、4、6、8ml,分别置于10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀。按上述色谱方法，取10μl注入液相色谱仪,测定,以进样量对峰面积进行线性回归。重复性试验取同一批燀苦杏仁，按“3.3.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，测定苦杏仁苷的平均含量与RSD。稳定性试验按“3.3.3”项下方法制备一份供试品溶液，分别在0h、2h、4h、6h、12h、14h时进行测定。4实验结果4.1燀苦杏仁水分测定结果燀苦杏仁水分测定结果如下表所示：表1燀苦杏仁水分含量测定表检验过程样品1样品2供试品重量（g）30.800930.8036水分测定管内读数（ml）0.710.71检测结果（%）2.302.30平均值（%）2.30由表1可知燀苦杏仁供试品平均水分含量为2.30%，未超过标准规定的7.0%，符合药典要求。4.2方法学考察4.2.1精密度试验精密吸取苦杏仁苷对照品溶液10μl，连续进样5次，计算得到峰面积RSD为0.27%。4.2.2线性关系考察精密吸取苦杏仁苷标准贮备液1、2、4、6、8ml,分别置于10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀。按上述色谱方法，取10μl注入液相色谱仪,测定,以进样量对峰面积进行线性回归，回归方程为y=10680x-2160,R2=0.9998，线性范围4.23～32.26μg/ml之间。4.2.3重复性试验 取同一批燀苦杏仁，按“3.3.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，测得苦杏仁苷的平均含量为3.95%，RSD为0.8%。4.2.4稳定性试验按“3.3.3”项下方法制备一份供试品溶液，分别在0h、2h、4h、6h、12h、14h时进行测定，测得苦杏仁苷的平均含量为3.83%，RSD为0.37%。4.3苦杏仁苷含量的测定结果对照品溶液：表2对照品溶液苦杏仁苷含量化合物名保留时间（min）峰面积浓度（mg/l）平均浓度（mg/l）苦杏仁苷20.89542489840.3340.33苦杏仁苷20.94842015240.33样品1：表3样品1苦杏仁苷含量样品号重量（g）化合物名保留时间（min）峰面积浓度（mg/l）平均浓度（mg/l）10.2664苦杏仁苷21.0413987503.633.63苦杏仁苷21.0323978293.62样品2：表4样品2苦杏仁苷含量样品号重量（g）化合物名保留时间（min）峰面积浓度（mg/l）平均浓度（mg/l）20.2517苦杏仁苷20.9643836533.723.73苦杏仁苷20.9333843923.73样品3：表5样品3苦杏仁苷含量样品号重量（g）化合物名保留时间（min）峰面积浓度（mg/l）平均浓度（mg/l）30.2554苦杏仁苷20.9454396904.174.18苦杏仁苷20.9324401834.18样品4：表6样品4苦杏仁苷含量样品号重量（g）化合物名保留时间（min）峰面积浓度（mg/l）平均浓度（mg/l）40.2521苦杏仁苷20.9284401514.234.24苦杏仁苷20.9114407914.24样品5：表7样品5苦杏仁苷含量样品号重量（g）化合物名保留时间（min）峰面积浓度（mg/l）平均浓度（mg/l）50.2525苦杏仁苷20.9014268914.104.10苦杏仁苷20.8954248984.10样品6：表8样品6苦杏仁苷含量样品号重量（g）化合物名保留时间（min）峰面积浓度（mg/l）平均浓度（mg/l）60.2580苦杏仁苷20.9184169463.913.92苦杏仁苷20.9194170183.92将上述样品1～6中的苦杏仁苷含量相关数据汇总成如下表格：表9样品1～6苦杏仁苷含量汇总样品号样品量（g）燀制时间（min）冷浸时间（min）含量（%)平均含量（%）脱皮难易10.2664213.633.63稍难脱皮3.6220.2517313.723.73易脱皮3.7330.2554414.174.18易脱皮4.1840.2521514.234.24易脱皮4.2450.2525614.104.10易脱皮4.1060.2580713.913.92易脱皮3.92根据以上得出的供试品溶液苦杏仁苷含量，对不同加热燀制时间后苦杏仁中的苦杏仁苷含量进行回归分析。通过原始数据采用曲线拟合的方法对原始数据进行曲线拟合，并得出对应的曲线回归方程，并通过曲线回归方程得出曲线的最高点坐标。通过对以上不同加热燀制时间后苦杏仁中的苦杏仁苷含量进行回归分析，得到苦杏仁苷含量随燀制时间变化趋势图，如图所示：图1苦杏仁苷含量随燀制时间变化趋势图由图1可知，苦杏仁苷含量在2～7min时间内，苦杏仁苷含量先随燀制时间的增加而增加，在某一时间有一最大值，之后随燀制时间的增加反而下降。通过对燀制时间对应的苦杏仁苷含量进行回归，并得出曲线方程，得到的曲线方程为y=-0.067x2+0.6791x+2.466，R2=0.8605，拟合程度好。由曲线方程可以求得其最高点坐标，最高点坐标为（5.06，4.18）。因此加热燀制时间为5min时，燀制后的苦杏仁中苦杏仁苷含量最高，为最优的燀制时间。5讨论苦杏仁中的苦杏仁苷具有提高机体免疫功能、抗炎镇痛等药理作用，成为近年研究的热点之一。夏其乐等[]研究发现苦杏仁苷具有抗肿瘤、调节免疫功能等药理作用。国外研究人员通过研究发现苦杏仁苷选择性杀死细胞，通过细胞周期阻滞促进细胞凋亡[]，TsaurLgor等[]的研究表明苦杏仁苷在紫杉烷耐药的前列腺癌细胞中发挥抗肿瘤活性。但有些研究者研究认为苦杏仁苷对癌症的治疗并没有作用，同时也没有发现具有减轻症状的临床效果[]。现代国内外研究者对于苦杏仁苷是否具有抗癌作用存在争议，这也进一步促进了对苦杏仁苷这一成分的研究。由于苦杏仁苷在一定条件下可分解产生氢氰酸，人摄入过多会出现中毒现象，故苦杏仁不能生食，需炮制减毒后方可食用。对苦杏仁进行燀制的目的就在于杀酶保苷，燀制既能杀死分解苦杏仁苷的酶又能保证苦杏仁苷的含量。传统燀制方法还主要停留在凭借人的主观经验控制水平，未制定统一的燀制工艺标准，无法保证每批燀制后的苦杏仁苷含量都能达标。本研究对不同加热时间燀制后的苦杏仁中苦杏仁苷含量变化进行研究，得出最优的加热燀制时间，优化了传统燀苦杏仁工艺参数。韦军等[]通过高效液相色谱法测定不同燀制时间后苦杏仁中苦杏仁苷的含量，发现苦杏仁苷含量在燀制时间为5min时燀苦杏仁中的苦杏仁苷含量最高，故本实验设置的燀制时间为2～7min，在此区间研究加热燀制时间对苦杏仁苷含量变化的影响。随着科技的不断发展，先进的仪器设备具备高精度、高稳定性及高性能等优势，为实验的顺利开展与进行提供了设备支持。现代对苦杏仁苷含量的测定方法有高效液相色谱法、薄层扫描法、毛细管电泳色谱法及电化学分析方法等[]，本实验采用高效液相色谱法测定不同加热时间后苦杏仁中苦杏仁苷的含量，分析速度快，方法简便操作简单，测定结果准确可靠。实验进行过方法学考察，精密度试验中测定得到苦杏仁苷峰面积的RSD为0.27%，远小于2%，表明实验中所用的高效液相色谱精密度高。而线性关系考察中，以进样量对峰面积进行线性回归，得到的回归方程中R2=0.9998，说明数据与拟合函数之间的吻合程度高，及进样量与对应峰面积的线性相关度高。通过方法学考察，验证了实验仪器精密度良好，供试品稳定性高，保证了实验能够顺利进行。实验前通过查询文献资料，将不同研究人员对苦杏仁苷含量测定所采用的色谱条件进行对比分析，最终选择《中华人民共和国药典》2020年版规定的苦杏仁苷含量测定色谱条件，该色谱条件下测定的苦杏仁苷含量准确可靠。实验操作过程中应确保色谱条件稳定，如遇到流速发生改变的情况可通过重新设定流速，使之保持稳定。如果出现柱温不稳定现象，则可采用恒温装置，保持柱温恒定。实验中检测波长设置为207nm，原因在于在此波长下苦杏仁苷有最大吸收，苦杏仁苷有最大峰面积，其他组分在该波长下无吸收，不会对苦杏仁苷吸收现象造成干扰。由于《中华人民共和国药典》2020年版规定苦杏仁苷含量的测定按干燥品计算，故需测定供试品的含水量。实验中燀苦杏仁供试品含水量为2.30%，未超过《中华人民共和国药典》2020年版规定的7.0%，符合要求。最后使用高效液相色谱仪，每组样品重复进样两次，每组样品得出两个含量测定结果，求其平均值作为最终苦杏仁苷含量，有效减小实验误差，使含量测定结果更具说服力。测定出样品1～6中的苦杏仁苷含量后，使用WPS软件，对不同加热燀制时间对应的苦杏仁中苦杏仁苷含量进行作图，并对图中的散点进行回归得到拟合曲线并得出拟合曲线的曲线回归方程，由图1可知拟合曲线呈倒U型，可看出苦杏仁苷含量先随加热时间的增加而增加，到达最高点后随燀制时间的增加反而下降。由图1可知，在加热时间为5min之前，苦杏仁苷含量随着加热燀制时间的增加而增加，是因为加热起到杀酶保苷的效果，之后随着加热燀制时间的增加，苦杏仁苷含量反而下降，原因是过度加热破环了苦杏仁苷的结构，故苦杏仁燀制过程中要控制好加热燀制时间，确保燀制后的苦杏仁苷含量符合《中华人民共和国药典》要求。通过计算得出拟合曲线最高点的坐标为（5.06，4.18），实验中加热燀制时间为5min时，苦杏仁苷含量为的4.24，为样品组中苦杏仁苷含量最高的组，与拟合曲线所预期的效果相符，故最佳加热燀制时间为5min。研究通过设置6组样品溶液，并对6组样品溶液中的苦杏仁苷含量进行测定，经过对实验数据的处理分析可知不同加热时间对燀制后苦杏仁中苦杏仁苷含量变化有明显的影响。参考文献国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2020:210.《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0213炮制通则.李科友,史清华,朱海兰,等.苦杏仁化学成分的研究[J].西北林学院学报,2004,19(2):124-126.赵宇瑛,尚冰,宋晓东.苦杏仁甙的研究进展[J].安徽农业科学,2005(06):1097-1098.刘兴隆,贾波,黄绣深,等.苦杏仁药理研究概况[J].江苏中医药,2005,226(7):59.刘梦培,铁珊珊,张丽华,等.杏仁及杏仁皮多酚超声提取优化及抗氧化能力差异性研究[J].食品工业科技,2017,38(27):159-169.张学兰,徐维芬.苦杏仁炮制研究[J].山东中医学院学报,1994,18(1):56-58.马雪松,陈缤.苦杏仁及其炮制品中苦杏仁苷含量测定[J].辽宁中医杂志,2006,33(3):355.夏其乐,王涛,陆胜民,等.苦杏仁苷的分析、提取纯化及药理作用研究进展[J].食品科学,2013(34):403-407.AliElDesoukyMohamed,AliFahmiAbdelgawad,MahmoudNasraldinKarima.ThePostulatedMechanismofActionofAmygdalin(VitaminB17)onCancerCells.[J].Anti-canceragentsinmedicinalchemistry,2022,23(8):894-899.TsaurIgor,ThomasAnita,MoneckeMichelle,ZugelderMarion,RutzJochen,GreinTimothy,MaxeinerSebastian,XieHui,ChunFelixK.H.,RothweilerFlorian,CinatlJindrich,MichaelisMartin,HaferkampAxel,BlahetaRomanA.AmygdalinExertsAntitumorActivityinTaxane-ResistantProstateCancerCells[J].Cancers,2022,14(13):3111.SpauldingAlbrightN.AReviewofSomeHerbalandRelatedProductsCommonlyusedinCancerPatient