离心法分离细胞核与线粒体

岗位演练离心法分离细胞核与线粒体1任务二细胞色素C原材料的预处理课前查阅资料，了解差速离心法分离细胞器的原理。查阅设计《离心法分离细胞核与线粒体操作记录》，在任务实施过程中同步填写。根据实训操作的具体步骤使用差速离心法，完成分离哺乳动物的细胞核与线粒体操作。设计实操设计（一）任务描述2（二）实训材料（1）仪器设备。解剖剪、解剖刀、烧杯、平皿、量筒、匀浆管、匀浆器、匀浆捣杆、纱布、载玻片、离心机、显微镜。（2）药品试剂。0.9％NaCl、预冷的0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液、l％甲苯胺兰、0.02％詹纳斯绿B染液。（3）实验动物。小鼠。3（三）实训操作030201制备小鼠肝组织涂片染色和显微观察高速离心分离提取线粒体4（三）实训操作步骤一

制备小鼠肝组织涂片（1）用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块（去除结缔组织）尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，除尽血污，用滤纸吸去表面的液体。（2）将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8mL预冷的0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。（3）剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。（三）实训操作步骤一

制备小鼠肝组织涂片（4）将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15min；缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；同时涂一张上清液片②，做好标记，自然干燥；余下的沉淀物进行下一步骤。（5）用6mL0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15min弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。步骤二

染色和显微观察（1）将①、②、③涂片用1％甲苯胺兰染色后盖片即可观察。（2）分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。（三）实训操作步骤三高速离心分离提取线粒体（1）将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17000rpm离心20min，弃上清，留取沉淀物。（2）加入0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙液1mL，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20min，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1mL0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液混匀成悬液（可用牙签）。（3）取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上（分别标记④、⑤涂片），各滴一滴0.02％詹纳斯绿B染液盖上盖片染20min。（4）油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。（四）任务分析与总结（1）以本任务为例，请简述如何对原材料进行预处理操作，列举出任务中用到了哪几种预处理技术？（2）请问固液分离技术有哪几种？固液分离技术是否仅适用于生产中预处理阶段？（3）选择题。①影响过滤性能的因素很多，主要有（）。

A.混合物中悬浮微粒的性质和大小

B.混合液的黏度

C.操作条件

D.助滤剂的使用

E.固液分离设备和技术②常用于脱脂的溶剂有（）。