儀器分析綜論课件

第二章儀器分析綜論第一節傳統分析與儀器分析第二節分析儀器種類第三節食品、營養生化分析常使用的分析儀器第四節儀器分析常用定量原理第一節傳統分析與儀器分析化學分析依儀器使用情形又可分成傳統或古典分析與儀器分析二種，以下將分別說明。傳統分析儀器分析傳統分析傳統分析常利用所謂的「溼的化學」“wetchemistry”，即在液體狀態下所進行的化學分析，通常必須先配製成溶液。食品分析中的粗估分析(proximateanalysis)即屬於此類。傳統分析的操作方法有沉澱、萃取及蒸餾等，偵測方式有靠顏色、氣味、光學活性、折射率與熔點、沸點等。傳統分析的優點是成本低且對所操作儀器的校正需求較低；但是缺點是缺乏靈敏度與特異性。一般傳統分析所採用的方法包括以下五種：滴定分析(titrimetricanalysis)：以標準溶液滴定待測溶液觀察到達滴定終點所需體積，最後利用當量平衡計算待測物濃度，屬容量分析的一種，例如：以滴定法測定滴定酸度或以凱式法(Kjeldahlmethod)測定粗蛋白(crudeprotein)。重量分析(gravimetricprocedures)：觀察脫水或加熱前後重量變化，例如：測水含量(moisturecontent)、灰分(ash)、粗纖維(fiber)等。溶劑萃取(solventextraction)：使用有機溶劑萃取後除去溶劑稱重，也屬重量分析，例如：索式萃取法(Soxhletextraction)測粗脂。折射學(refractometry)：折射率(refractiveindex)=sini/sinr，其中i為入射角，r為折射角。利用折射率與試樣溶液中待測物濃度有關的原理，例如：使用糖度計(saccharimeter)測定糖水中的糖濃度。旋光度或偏極化(polarimetry)：使用偏極計利用旋光度β=αlc方式求得待測物濃度，公式中α為比旋光度（指1g/mL溶液在1dm長試樣槽、20℃、波長589.3nm的旋光度），l為試樣槽長度(dm)，c為濃度(g/mL)。在食品簡易分析中此法常被用來測定糖濃度。雖然傳統分析有時也會使用一些儀器，例如：糖度計的量測計(meter)或索氏萃取器的裝置(apparatus)，但因大多未使用精密電子組件，因此較少被歸類為儀器分析。儀器分析相對傳統分析而言，儀器分析具有快速、靈敏度高、再現性高、檢測極限低等優點。儀器分析的操作方法為層析分離等，偵測方式則包括輻射的吸收與放射、導電度及電極電位等。儀器進行化學分析主要是分析元素或分子的定性或定量，在食品及藥粧品領域中較常進行分子或化合物的定量。儀器分析依待測物質性質可分成無機和有機性，在無機物元素定性分析最常使用為感應偶合電漿分析(inducedcoupledphotometry；ICP)和為感應偶合電漿-質譜(inducedcoupledphotometry-massspectrometry；ICP-MS)。有機物的定性分析，可利用紅外線光譜(infraredspectrometry；IR)推斷特定官能基，再以核磁共振儀(nuclearmagneticresonance；NMR)分析原子相對位置，並以質譜找出分子量；若為混合物則需先利用層析分離純化後，再進行結構分析。在定量上則常用光譜分析和層析分析來進行。在儀器分析科學領域中，除分析化學性質外，也有針對物理性質分析的儀器，例如：本書所提及的流變儀等。儀器分析前通常須進行一些前處理流程，以適合最後的分析。以下為一般成分複雜的天然物進行的步驟，即將混合物逐步粗分、細分後成為純物質，最後進行定性或定量。儀器分析林志城編著取樣均勻化區分分離分析取樣均勻化有時是為了取樣方便而使用的步驟，因此也會在取樣之前進行。均勻化的處理方式很多，例如：分切、研磨、溶解及分散等，主要目的是幫助後續步驟的進行。區分其意義在於將樣品分成幾個部分(fraction)，使不同性質的部分被區分開來。區分的方法很多，包括：萃取（利用極性區分）、離心過濾（利用比重區分）、蒸餾或分餾（利用沸點區分）、蒸發（利用蒸氣壓區分）、電析（利用電性區分）及層析（這裡指的是製備型管柱）等。成分越複雜的樣品越應執行此部分，否則後續的分析容易有複合效應(matrixeffect)或受到雜質干擾。分離分析即本書所提及的各種分析儀器，採用種類依其試樣型態（固體、液體與氣體）或分析目的（定性或定量）而異。許多分析儀器可自動化的同時分離和分析，例如：最常見的高效能液相層析儀聯結紫外光／可見光偵測器(HPLC/UV-Vis)或氣相層析儀聯結質譜儀分析(GC/MS)等。第二節分析儀器種類分析儀器依偵測性質主要可分成電磁輻射和電子訊號，以偵測訊號分類各種儀器分析方法如下：電磁輻射：輻射的放射：放射光譜（X-ray、紫外線、可見光）、螢光、磷光、化學發光。輻射的吸收：光譜法、光度法（X-ray、紫外線、可見光、紅外線）、原子吸收光譜、核磁共振、電子自旋共振。輻射的散射：濁度測定法。輻射的折射：折射法。輻射的繞射：X-ray繞射。輻射的轉動：偏光法、旋光度法。電子訊號：電位：電位法。電荷：電量測定法。電流：電流滴定法、極譜分析法。電阻：電導度測定法。當然除此二類外，操作方法的層析法是以分離為目的，但為偵測所分離出來成分的定性與定量，就會聯結上述所列的偵測器，例如：高效率液體層析分析會聯結如紫外光／可見光偵測器(UV/Vis)、螢光偵測器(fluorescencedetector)、折射率偵測器(refrectiveindexdetector；RI)等輻射訊號儀器；氣體層析分析會聯結如熱傳導偵測器(thermalconductivitydetector；TCD)等電子訊號儀器。尚有許多如偵測重量的熱重分析法等。不同之分析儀器有不同適用的時機，如表2-1所示，有些分析儀器適用於分析分子或化合物；有些適用於分析原子或元素；有些適用於定性；有些適用於定量。儀器分析林志城編著分析分子或化合物的儀器元素分析儀器分析分子或化合物的儀器其實分析儀器日新月異且種類繁多，許多新型態偵測方式持續被開發。有關分子或化合物的分析儀器主要有以下13種：可見光光譜紫外光吸收光譜紫外光螢光光譜紅外線光譜核磁共振X-射線繞射X-射線吸收輻射追蹤技術質譜熱分析氣相層析分析高效能液相層析分析電子顯微術可見光光譜利用特定試劑使無機物或有機物生成在特定波長吸收的元素或化合物，此產物若為有顏色物質，可稱為顏色測定分析(colorimetricanalysis)或可見光光譜分析(visiblespectrophotometricanalysis)。這種方法是最普遍被使用，且常作為例行性定量分析方法，靈敏且具有選擇性。紫外光吸收光譜紫外光吸收光譜分析在定性上可鑑定特定的官能基、含π鍵的不飽和化合物與芳香族，在定量上可以運用於天然物中不飽和化合物的例行性分析。此法易受干擾物質對光譜重疊影響，且較少應用於微量分析。紫外光螢光光譜紫外光螢光光譜分析利用於特別是芳香族的不飽和化合物，雖不能判斷分子量，但可相當程度指出某些官能基，且較紫外光吸收光譜分析靈敏。紫外光螢光光譜分析是非常靈敏的方法，其偵測濃度可至10－8g/g或10ppb，但仍需注意干擾物質的光譜重疊影響和壓制效應(quenchingeffect)。紅外線光譜核磁共振定性上主要用於鑑定有機分子中氫(H)和碳(C)型式，可判別出官能基的相對位置；也可指出是否含有異元素，例如：硫、氮、鹵素。雖然也可用於測定百分率濃度，但對於微量測定可能不夠準確。X-射線繞射X-射線繞射被用於測定晶格，或是鑑定結晶與土壤、聚合物、天然物等的結構和組成。在生化上可用於分析純化蛋白質的三度空間結構，在定量上可用於測定混合物中結晶比率。X-射線吸收X-射線吸收主要用來檢測高分子量元素在低分子量複合物(matrix)的位置或固體試樣中的空洞，例如：海關檢查皮箱內容物、人體中骨頭位置等。輻射追蹤技術藉由輻射標示(radiolabeling)的化合物可以追踪其在生物體、工廠或河川等系統中的路徑或流向。質譜質譜可分析高分子量無機物或有機物的分子量，也可鑑定成分官能基和結構。在定量上廣泛的應用於測定液體和氣體試樣中成分含量。熱分析熱分析可分析無機物和部分有機物的相變化、加熱時化學變化、熱變化圖、熱融合、熔點、沸點、乾燥過程、分解過程或是化合物的純度。此法缺乏靈敏度不適合微量分析，但可在高濃度範圍分析定量無機物中成分含量。氣相層析分析利用氣相層析儀可藉滯留時間定性分析氣體或低沸點分子，但通常必須和標準品比對才能進一步作鑑定。氣相層析分析是廣泛使用於定量有機物或無機物的方法，利用和標準品比較波峰面積可準確地進行定量。高效能液相層析分析利用液相層析分析儀可藉滯留時間定性分析液體樣品，不過通常必須藉由和標準品比對才能進一步作鑑定。液相層析分析是廣泛使用於液態或溶液、高分子量分子或熱不安定物質之定量分析，對於如天然動植物等複雜試樣的分離定量特別有用。電子顯微術主要用於分析觀察結晶或植物、細胞、組織、微生物等表面和結構。元素分析儀器有些儀器用於分析元素，以下5種為常見元素分析儀器：放射光譜分析包括電漿放射(plasmaemission)或感應偶合電漿分析等放射光譜分析是金屬元素定性、定量分析的最佳方法，其偵測範圍很廣，從ppm(10－6)至百分率(10－2)皆具靈敏度。感應偶合電漿質譜分析(ICP-MS)可同時偵測多個金屬元素分析，偵測範圍從ppb(10－9)至百分率(10－2)皆具線性關係，也可提供元素中同位素分布的資訊。原子吸收光譜分析原子吸收光譜雖然無法利用於定性分析，但是此法是定量測定金屬或金屬類化合物的最準確、最靈敏的方法，以絕對量而言可測至10－14g。不過此法不能測定非金屬。X-射線螢光分析定性上X-射線螢光分析用於分析原子數大於10的金屬或非金屬。在定量上可測定特別是高分子量的元素，具靈敏度且準確度高。電子分光術主要利用於試樣的表面分析，靈敏度高到可偵測原子數目；電子分光術僅能作半定量分析，但分析結果可顯示分析元素在表面的分布。第三節食品、營養生化分析常使用的分析儀器構造分析儀器：紅外線光譜、核磁共振儀、質譜、X-ray繞射分析。成分物化性質分析儀器：色差儀(colordifferencemeter)、流變儀(rheometer)、差示掃瞄熱分析儀(differentialscanningcalorimeter；DSC)、電泳。成分定量儀器分離定量用儀器構造分析儀器成分物化性質分析儀器成分定量儀器除折射率分析外，光譜分析是最普遍且方便的定量儀器，光譜(spectrum)是指光的圖譜，光譜可由訊號對不同波長作圖產生。粒子會「吸收」能量或輻射「激發」(exciting)至高能階的激發態，而在高能階會藉鬆弛(relaxing)過程釋放能量回到低能階。釋放能量的方式包括：(1)非輻射鬆弛（振動鬆弛），導致環境溫度上升；(2)輻射鬆弛，如螢光。光譜分析是研究原子、分子或化學物種與電磁輻射(electromagneticradiation)間的交互作用，透過測定輻射被吸收或放射可偵測許多成分。雖然原子和分子皆有其吸收與放射光譜，但是其中最廣泛被使用是吸收光譜分析，特別是生化領域主要為有機分子，分子吸收光譜尤其重要；放射光譜分析則常被利用於特定礦物質的測定。而光譜分析技術與其使用電磁輻射波長區域有關，例如：紫外光吸收光譜分析指在紫外光區吸收輻射所獲得的資訊。分析所使用到的波長區域在X-ray至紅外線IR區域。光譜分析方法在儀器分析中常被使用來進行定性分析與定量分析。運用在生化、食品、藥物領域的光譜法(spectroscopicmethods)主要有以下重要種類：顏色學(colorimetry)和紫外光／可見光光譜分析(UV/visiblespectrophotometry)。紅外光譜分析(infraredspectophotometry；IR)。近紅外線光譜分析(nearinfraredspectrophotometry；NIR)。螢光光譜分析(fluorimetry)。光譜分析依與輻射作用性質又可分成吸收光譜、放射光譜和螢光光譜，此區分可以利用儀器組件配置來完成。光譜分析主要組件包括輻射源、分光器或波長選擇器、試樣槽和偵測器。依圖2-1所示四個組件的配置位置而有不同光譜分析儀器。圖2-1中箭線表示光行進路線，螢光光譜分析儀器中光源輻射所產生的為箭頭實線，激發試樣產生螢光為箭頭虛線。儀器分析林志城編著與吸收光譜分析儀器不同的是放射光譜的輻射源來自試樣本身所產生，所以通常不需外加輻射源。而螢光光譜分析儀器原輻射源光行進路線與激發所產生的螢光路徑呈直角，W1選擇激發波長，而W2選擇放射波長。光譜分析依測定使用的波長區域又可分成紫外光光譜分析(UV)、可見光光譜分析(visible)、紅外光譜分析(IR)等。其中螢光光譜區域多在可見光區域。整理此幾種儀器在輻射源和試樣槽材質上的差別如表2-2，在使用上需注意以免獲得錯誤資訊。儀器分析林志城編著在食品與生化營養分析應用上，以吸收光譜分析與螢光分析較常被利用。紅外線吸收光譜分析因光譜較具特異性適合用於定性分析；紫外光或可見光吸收光譜分析則因較不受波長變動所導致的吸收度偏差，符合比爾定律(Beer'slaw)，可適用於定量分析；螢光光譜分析適用於定量分析，因其可藉由激發光譜與螢光發射光譜的資訊，而可運用於定性分析。分離定量用儀器層析分析由固定相(stationaryphase)、移動相(mobilephase)與試樣組成，其分離原理是利用固定相與移動相對試樣中不同的成分有不同的作用力而達到分離的效果。作用力與移動相和固定相的型態有關，大致可分列如表2-3。儀器分析林志城編著固定相中的L其實並不是真正的液體，在高效能液相層析指的是經移動相沖提後而膨潤的膠體，在氣相層析指的是經加熱後會成液膠狀的物質。移動相的型態代表試樣應具備的條件，也就是說液相層析是用來分析液體或可溶解成溶液的試樣，氣相層析是用來分析氣體或加熱具揮發性的試樣。高效能液相層析分析儀與氣相層析分析儀主要組件與其功能如表2-4所示：儀器分析林志城編著層析分析最希望達成的結果是最短的時間有最好的分離，效果佳的分離必須靠以下條件來完成：適當挑選固定相與選取管柱效率(columneffiency)高的管柱。設計或選擇合宜的分析條件。此部分在液相層析靠調整移動相組成來控制，在氣相層析靠調整溫度變化或升溫條件來控制。進行定量之前通常需先定性，欲利用層析分析進行定性時，當然若有聯結質譜儀可直接比對資料庫中圖譜推斷成分結構，但若無質譜可利用比對標準品滯留時間(retentiontime)與成分滯留時間方式來推測。層析分析之定量分析則可利用成分波峰高度或波峰面積(peakarea)計算求得，定量原理詳見下節。構造分析儀器構造分析儀器主要有紅外線吸收光譜分析、核磁共振、質譜分析、X-射線繞射分析等，這些儀器分析的前提是試樣必須為純物質。分子內的化學鍵結所表現的振動現象，因其電荷分布與電偶極矩發生變化而導致分子吸收紅外線。化學結合方式不同會含有不同能量，可藉由其對光的吸收不同而測定性質。紅外線的能量大小相當於原子間的鍵結之振動與轉動所引起的能量變化，測定化合物紅外線的吸收性質即能推斷其官能基。紅外線吸收光譜和紫外線或可見光光譜最大的不同是各物種光譜有特異性，即不同物種有不同的紅外光譜。利用已知物的吸收光譜比對未知物在特定吸收波長、強度等特性，可解析分子結構，特別在指紋區(fingerprintregion)每種物質各有其特徵。同分異構物也可藉紅外線吸收光譜來分辨。質譜可由訊號對不同質荷比作圖產生，質譜儀主要用來進行定性分析或鑑定結構(identification)，常聯結分離儀器如氣相層析作為偵測器。利用質譜分析則能獲得化合物元素組成結構與分子量。但若為複雜結構則需配合核磁共振儀鑑定。所謂核磁共振係因1H或13C在磁場中會因原子核周圍的電子因環境的不同而導致對無線電波吸收性質的不同，由此特性可以獲得分子構造環境的相關資訊。而藉由X-射線繞射分析可瞭解結晶中原子的立體排列的相關資訊。成分物化性質分析儀器天然物的新發現物質或製造的新產品，除上述定性和定量分析外，尚需分析成分的物化性質以作為開發進一步用途或作為品管上原料驗收、製造品管與產品保證之目的。物理化學性質，包括：物質的顏色、質地(texture)、熱性質、電性與表面結構等，這類儀器在化工、製藥、電機上使用較多。色差儀(colordifferencemeter)用來描述顏色，通常最後分析結果可利用Lab系統來表達。在以L、a、b三個軸的系統中，L表亮度；a表紅色、-a表綠色；b表黃色、-b表藍色，數據結果將以在三度空間的位置來描述其顏色。流變儀用來分析質感或流變性質(rheologicalproperties)，有黏度計(viscometer)、也有分析澱粉的澱粉流變儀(amylograph)等，主要原理是利用施予機械力至待測物後偵測液體的流動性質變化或固體的變形。以黏度計為例，利用應力等於流動速度乘以黏度的公式，可觀察待測物的黏度。同樣原理用在固體就可瞭解物質的彈性等性質。掃瞄式電子顯微鏡(scanningelectronmicroscopy；SEM)等光學儀器被利用來分析表面結構或拓蹼學。而電泳牽涉到物質的電性，故也有人將電泳歸為物化分析儀器。分析物質熱性質的熱重分析儀(thermalgravimetricanalyzer；TGA)或差示掃瞄熱分析儀(differientialscanningcalorimeter；DSC)，可用於分析物質熱性質，例如：糊化溫度、熱分解、玻璃轉移溫度等。有廠商將示差掃瞄熱分析儀與紅外光譜分析儀結合，可同時觀察物質受熱後熱性質與紅外光譜的改變。第四節儀器分析常用定量原理新成分或化合物的定性分析主要是化學分析研究人員常進行的主題，利用各種構造分析儀器分析所得各項資訊推斷鑑定結構。在食品營養、藥粧領域中則較常進行分子、化合物或已知成分的定量，以對於配方調製或產品成分品質控制等，我們甚至可以說利用儀器進行成分定量分析，是食品、藥品分析人員最基本應具備的專業技術。外標準法內標準法標準品添加法外標準法外標準法又可稱為標準曲線法(standardcurvemethod)，原理是配製一系列不同濃度或量的標準品或標準溶液，以所獲得的系列訊號測定值（縱軸）對濃度或量（橫軸）作圖，即標準曲線，有時測定值與濃度或量並無法完全符合方程式曲線，此時就需進行迴歸(regression)以獲得校正曲線(calibrationcurve)，所以有時會稱為校正曲線法。儀器分析定量上最常利用為直線（一元一次方程式）的線性關係，此時所獲得的直線就是所謂的檢量線。現行藥品優良製造規範－分析確效作業指導手冊提及：討論線性時，應以目測法評估被分析物之濃度或含量與分析所得之訊號之強弱是否可呈線性關係。若可呈線性關係，則應再將試驗結果利用適當的統計學方法來評估，例如：利用最小平方法之迴歸線。有時為要使含量測定結果與檢品濃度間呈現線性關係，得在線性迴歸之前利用數學轉換技術作預處理。迴歸線的相關係數、縱軸截距、斜率與殘差平方和等應列入報告中；數據的作圖也應予以列入。必須提醒的是欲建立線性關係，建議最少要用到五個濃度。吸收光譜分析與螢光光譜分析其定量分析原理，主要是利用稀薄溶液在固定波長、光徑固定下、訊號與濃度成正比的原理來進行。在定量前基線或溶劑吸收(baselineabsorption)的校正是獲取正確資訊的前提。配製標準液時需注意稀釋倍率與母液(stocksolution)調製，且許多呈色物質的較不安定會隨時間變化，應該於特定時間範圍內完成測定。以下舉光譜分析為實例陳述標準曲線法定量流程：【範例】假設欲以可見光光譜分析測定試樣中“A”成分含量。配製1.08mg/mL“A”母液(stocksolution)：分別取1、2、3、4、5mL定量至10毫升，得0.108、0.216、0.324、0.432、0.54mg/mL。取1mL分別添加呈色劑反應後測得在500nm吸收度為0.11、0.21、0.29、0.39、0.52。這裡需注意若所測得的吸收度超過1，應重新配製較低濃度的標準液；另外每一個吸收度為四次以上測定平均值。接著以吸收度對濃度作圖得標準曲線如圖2-2，再以電腦統計作圖軟體迴歸求得斜率0.9259、截距0.004，即Y＝0.9259X＋0.004直線畫出為檢量線其迴歸係數RSQ為0.992851，接近1表示符合線性關係可信度高。若取樣品5g溶於1,000m