生化实验提取与电泳

实验一组织细胞中基因组DNA的提取实验二琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段（水平潜水式）实验一原理样品研磨或者匀浆后加入细胞核裂解液，1、首先在强去污剂或者和蛋白酶K协同下裂解细胞释放出基因组DNA；2、接着加入RNaseA去除RNA；3、然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白；4、最后纯净的DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。操作步骤1、600μl冰预冷的细胞核裂解液加入10-20mg新鲜组织用小匀浆器匀浆10s，将裂解物转入1.5mlEP管；(4ml)2、将裂解物放置在65℃水浴10min；3、冷却，加入RnaseA(10mg/ml)1.8μl至裂解物中裂解物中至终浓度30μg/ml，颠倒混匀，37℃温育10min去除残留RNA；室温冷却；4、裂解物中加入200μl蛋白沉淀液，涡旋振荡器上高速连续振荡混匀25s，然后冰浴3min；5、13,000rpm离心5min;6、小心缓慢吸取600ul上清到一个新的1.5ml

EP管中，勿吸动沉淀；7、加入等体积的室温异丙醇（约600μl），颠倒30次混匀或直到出现棉絮状（丝状）白色DNA沉淀，12,000rpm离心1min；8、弃上清液，加入1ml70%乙醇后，颠倒漂洗DNA沉淀，12,000rpm离心1min，弃上清液，倒置在吸水纸上轻敲几下，空气晾干沉淀几分钟;9、加入100μl溶解液，EP管做好标记，冰箱-20℃保存至下周。1、DNA溶液放置在65℃温育20min，中间不时轻弹管壁帮助重新水化DNA；操作步骤二（接上周实验）实验二琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段（水平潜水式）

原理：分子筛效应溴乙锭(ethidiumbromide,EB)，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，籍此可分析实验结果。1.凝胶槽准备：将电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净、晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。2.制备琼脂糖凝胶：按照被分离的DNA分子的大小选择合适浓度的琼脂糖凝胶。称取一定量的琼脂糖，置于锥形瓶中，加入电泳缓冲液1×TAE，置微波炉或水浴锅中加热至琼脂糖全部融化。3.灌胶：待凝胶冷却至60℃左右加入溴化乙啶(终浓度0.5μg/mL)，混匀后小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层（应注意胶面平整，无气泡），室温下冷却凝固。待完全凝固后，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液使之高出胶面1～3mm。4.加样：在点样板上混合DNA样品和上样缓冲液（上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1×），然后加入胶板的样品小槽内。在样品一侧的样品小槽中加入分子质量标准（DNALadder）。注意加样前要先记下加样的顺序，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。5.电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压100V，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm