某大学《基因工程》课程考试试卷(含答案)

PAGE第1页共1页院系：________________专业班级：______________姓名：院系：________________专业班级：______________姓名：_________学号：_______装订线适用专业试卷所需时间试卷总分100分考试日期开卷/闭卷成绩一、名词解释（共10小题，每小题1分，共10分）1、粘性末端2、基因工程3、质粒的不相容性4、基因组文库5、克隆(clone)6、电击转化法7、重组PCR8、限制性酶切图谱法9、质粒10、重组率的定义二、填空题（共10小题，每小题1分，共10分）1、在基因克隆中碱性磷酸单酯酶的主要用途有：A、在用P标记DNA5′端之前；B、在DNA重组技术中，去除DNA片段的，可防止酶切后的载体的与。2、载体的功能是运送高效转入；为外源基因提供能力或能力；为外源基因的或提供必要的条件。三、简答题（共10小题，每小题4分，共40分）1、载体应具备的条件是什么？2、受体细胞应具备的条件？3、蓝白斑筛选原理是什么？4、PCR克隆目的基因的基本程序是什么？5、酵母菌表达外源基因的优势是什么？6、营养缺陷型的哺乳动物受体细胞的遗传标记是什么？7、λ-DNA作为载体的优点是什么？8、巴斯德毕赤酵母表达系统特征及优势是什么？9、融合蛋白表达质粒的构建原则是什么？10、分泌型目的蛋白表达系统的构建策略是什么？四、论述题（1-2每小题8分，3-4题每小题12分，共40分）1、论述PCR原理及引物设计的基本原则。2、强化转录终止的必要性是什么？3、请论述λ-DNA载体的构建策略是什么。4、请论述植物基因工程的共整合转化程序和二元整合转化程序及二元整合转化程序的特征。院系：________________专业班级：______________姓名：_________学号：_______院系：________________专业班级：______________姓名：_________学号：_______装订线院系：________________专业班级：______________姓名：_________学号：_______装订线适用专业试卷所需时间试卷总分100分考试日期开卷/闭卷成绩一、名词解释（共10小题，每小题1分，共10分）1、粘性末端因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。2、基因工程指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。3、质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群。4、基因组文库将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。5、克隆(clone)作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系，作动词时是指基因的分离与重组过程。6、电击转化法酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大的负作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广，而且转化率可高达105/mgDNA。7、重组PCR在两个PCR扩增体系中,两对引物分别由其中之一在其5’-端和3’-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。8、限制性酶切图谱法所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。9、质粒质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。10、重组率的定义重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数，在常规实验条件下，重组率一般为25-75%，重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。二、填空题（共10小题，每小题1分，共10分）1、在基因克隆中碱性磷酸单酯酶的主要用途有：A、在用P标记DNA5′端之前，去除5′端的磷；B、在DNA重组技术中，去除DNA片段的5′磷酸集团，可防止酶切后的载体的自身连接与环化。2、载体的功能是运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。三、简答题（共10小题，每小题4分，共40分）1、载体应具备的条件是什么？具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点；具有合适的筛选标记。2、受体细胞应具备的条件？限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）重组整合缺陷型，用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）具有较高的转化效率，具有与载体选择标记互补的表型，感染寄生缺陷型，防止重组细菌扩散污染，生物武器除外。3、蓝白斑筛选原理是什么？Amoresophisticatedprocedurecanbecarriedoutonasingletransformationplate;Bluewhitescreening;InvolvestheinsertionalinavtivationofthegenelacZ.lacZ’:编码-半乳糖苷酶a-肽N端，TheinsertionofaDNAfragmentinterruptstheORF（开放阅读框）oflacZ’gene,resultinginnon-functionalgeneproductthatcannotdigestitssubstratex-gal。4、PCR克隆目的基因的基本程序是什么？由TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为TaqDNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T5、酵母菌表达外源基因的优势是什么？全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便；具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统；大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉；能将外源基因表达产物分泌至培养基中；不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（GenerallyRecognizedAsSafeGRAS）；酵母菌是最简单的真核模式生物。6、营养缺陷型的哺乳动物受体细胞的遗传标记是什么？含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk-）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补。含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞（hprt-）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因hprt与之遗传互补。7、λ-DNA作为载体的优点是什么？λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌，λ-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量，重组λ-DNA分子的筛选较为方便，重组λ-DNA分子的提取较为简便，λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。8、巴斯德毕赤酵母表达系统特征及优势是什么？巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。9、融合蛋白表达质粒的构建原则是什么？受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件，两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架。10、分泌型目的蛋白表达系统的构建策略是什么？包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。四、论述题（1-2每小题8分，3-4题每小题12分，共40分）1、论述PCR原理及引物设计的基本原则。答案要点：PCR是在体外扩增DNA序列的方法，原理并不复杂，首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。包括：DNA解链（变性）、引物与模板DNA结合（退火）DNA合成（延伸）三步，可以被不断重复。2、强化转录终止的必要性是什么？外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。3、请论述λ-DNA载体的构建策略是什么。1）λ-DNA载体的构建：缩短长度，野生型λ-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型λ-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型λ-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的（除去非必需区段，除去左右两臂必要区域中的限制位点代以ＭＣＳ，插入选择位点如Ｌac）。根据切除的多少，可将λ-DNA分成两大类载体：插入型载体，取代型载体。2）λ-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点，野生型的λ-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个，同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点。3