微生物综合实验报告

微生物综合实验报告姓名：杨延景班级：食品1101学号：32指导老师：郭永目录项目一食品中菌落总数的测定前言…………3实验目的…………………….3实验原理………………….3实验器材……………………3实验步骤……………………4实验结果以及分析………7国标中微生物菌落总数标注......................7项目二大肠菌群的测定实验目的……………………9实验原理………………9实验器材……………………9实验步骤……………………10实验结果以及分析…………15项目三革兰氏染色实验器材……………………18实验步骤……………………18实验结果……………………18 四实验感想项目一食品中菌落总数的测定前言随着生活人们生活水平的提高，和社会的发展与进步食品安全问题越来越受到人们的关注，然而食品方面的问题这几年也越来越突出，食品安全问题屡见不鲜。由前几年的“苏丹红红心鸭蛋”再到这几年的“三聚氰胺奶粉事件”和“瘦肉精事件”还有“地沟油”等等一系列的事件都不得不让人们对食品安全问题高度关注。然而食品中微生物的菌落总数是用来判定食品被细菌污染的程度即清洁状态及其安全质量，它反映食品在生产过程中是否符合国家食品安全标准要求，以便对被检样品做出适当的食品安全评价。然而微生物的检测主要依靠菌落总数(colonycount)的测定，菌落总数的测定是指食品检样经过处理，在一定的条件下(样品处理、培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧条件)培养后，所得到的每单位食品(1g、1mL或1cm2)中所含细菌菌落的总数。所以说通过这些实验让我们更好的掌握菌落总数的测定一方面要求和配置；.掌握我国食品安全标准中微生物检验指标及意义；.掌握常见各类食品微生物检验采样方法；.掌握食品微生物检验各项指标检验方法和技能；在我们以后的日常工作和学习中更好的为人们服务。实训一食品中菌落总数的测定一、实验目的1.学习并掌握食品中菌落总数的原理和基本方法，以判别食品的质量；2.体会食品菌落总数检验的目的和意义。二、实验说明菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行食品安全与质量评价时提供依据。三、实验器材1．培养基：平板计数琼脂培养基，磷酸盐缓冲液，无菌生理盐水。2．仪器用具：恒温培养箱（36℃）、恒温水浴锅、酒精灯、试管架、无菌培养皿、无菌移液管（10mL和1mL）、无菌不锈钢勺、酒精灯。四、操作步骤图9-1食品中菌落总数的测定1．取样、稀释（1）以无菌操作，取检样25g（或25mL）剪碎放于含有225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨制成1:10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000～10000r/min的速度处理1min，制成1:10的均匀稀释液。（2）用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1:100的稀释液。（3）另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此再递增稀释一次。（4）根据对样品污染情况的估计选择2～3个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。（5）及时将15～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。2．培养（1）待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，水产品30±1℃培养72±3h。（2）如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按上述条件进行培养。3.菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，cfu）表示。3．菌落计数（1）选取菌落数在30～300cfu之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30cfu的平板记录具体菌落数，大于300cfu的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。（2）其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。（3）当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。4．菌落总数的计算方法（1）若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。（2）若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按以下公式计算：式中：N——样品中菌落数ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d——稀释因子（第一稀释度）。示例：稀释度1:100（第一稀释度）1:1000（第二稀释度）菌落数（cfu）232,24433,35上述数据修约后，表示为25000或×104。（3）若所有稀释度的平板上菌落数均大于300cfu，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。（4）若所有稀释度的平板菌落数均小于30cfu，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。（5）若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。（6）若所有稀释度的平板菌落数均不在30～300cfu之间，其中一部分小于30cfu或大于300cfu时，则以最接近30cfu或300cfu的平均菌落数乘以稀释倍数计算。5．菌落总数的报告（1）菌落数小于100cfu时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。（2）菌落数大于或等于100cfu时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。（3）若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。（4）若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。（5）称重取样以cfu/g为单位报告，体积取样以cfu/mL为单位报告。五、实验结果示例稀释度1:100（第一稀释度）1:1000（第二稀释度）菌落数（cfu）232,24433,35上述数据修约后，表示为25000或×104。国标中的菌落总数1、膨化食品的落菌总数标准依据国家强制性标准GB17401-2003《膨化食品卫生标准》规定，膨化食品的菌落总数应为≤10000cfu/g、大肠菌群应为≤90MPN/100g，超过国家标准规定可判断为不合格膨化食品。2、固体饮料的落菌总数标准依据国家强制性标准GB7101-2003《固体饮料卫生标准》规定，固体饮料产品的菌落总数应≤1000cfu/g；大肠菌群应≤90MPN/100g；霉菌应≤50cfu/g，超过国家标准规定可判断为不合格固体饮料。3、糕点、面包、月饼的落菌总数标准糕点、面包、依据国家强制性标准GB7099-2003《糕点、面包卫生标准》规定，月饼产品中菌落总数不得超过1500cfu/g，大肠菌群不得超过30MPN/100g，霉菌计数不得超过100cfu/g；蛋糕生产的标准要求：菌落总数≤10000cfu/g，大肠菌群≤300MPN/100g，霉菌≤150cfu/g，超过国家标准规定可判断为不合格糕点类产品。4、食醋的落菌总数标准依据国家强制性标准GB2719-2003《食醋卫生标准》规定，食醋中菌落总数不得超过10000cfu/mL，超过国家标准规定可判断为不合格食醋。5、冷冻饮品的落菌总数标准依据国家强制性标准《冷冻饮品卫生标准》规定，含淀粉或果类的冷冻饮品菌落总数应≤3000cfu/g,大肠菌群应≤100MPN/100g；含乳蛋的冷冻饮品的菌落总数应≤25000cfu/g,大肠菌群应≤450MPN/100g，超过国家标准规定可判断为不合格雪糕或冷饮。6、饼干的落菌总数标准依据国家强制性标准GB7100-2003《饼干卫生标准》规定，非夹心饼干的菌落总数不得超过750cfu/g，夹心饼干菌落总数不得超过2000cfu/g；饼干产品的霉菌计数不得超过50cfu/g，超过国家标准规定可判断为不合格饼干。7、巴氏杀菌、灭菌乳的落菌总数标准巴氏杀菌、依据国家强制性标准GB19645-2005《巴氏杀菌、灭菌乳卫生标准》规定，灭菌乳菌落总数不得超过10cfu/g，大肠菌群不得超过3MPN/100g，超过国家标准规定可判断为不合格乳制品。8、蜜饯的落菌总数标准依据国家强制性标准GB14884-2003《蜜饯卫生标准》规定，蜜饯食品中菌落总数不得超过1000cfu/g；霉菌不得超过50cfu/g，超过国家标准规定可判断为不合格乳蜜饯产品。9、调味品的落菌总数标准调味品的落菌总数标准依据SB／T10371-2003《鸡精调味料》标准规定，鸡精调味料中大肠菌群不得超过90MPN／100g，超过国家标准规定可判断为不合格鸡精产品。10、瓶装水的落菌总数标准依据国家强制性标准GB17324-2003《瓶装饮用纯净水卫生标准》规定，饮用纯净水的菌落总数应≤20cfu/ml，大肠菌群≤3MPN/100ml；强制性国家标准GB19298-2003《瓶（桶）装饮用水卫生标准》规定，饮用水的菌落总数应≤50cfu/ml，大肠菌群应≤3MPN/100ml；强制性国家标准GB8537-1995《饮用天然矿泉水》规定，天然矿泉水的菌落总数为<50cfu/ml，大肠菌群为0。若超过国家标准规定可判断为不合格纯净水或矿泉水。11、酱腌菜的落菌总数标准依据国家强制性标准GB2714-2003《酱腌菜卫生标准》规定，酱腌菜产品的大肠菌群不得超过30MPN/100g，若超过国家标准规定可判断为不合格酱腌12、食糖的落菌总数标准依据国家强制性标准GB13104-2005《食糖卫生标准》规定，白砂糖、绵白糖的菌落总数不得超过100cfu/g，超过国家标准规定可判断为不合格糖制品。13、肉干、肉铺的落菌总数标准肉干、依据强制性国家标准GB2726-2005《熟肉制品卫生标准》规定，肉制品中大肠菌群不得超过30MPN/100g，超过国家标准规定可判断为不合格肉制品。14、油炸小食品的落菌总数标准依据国家强制性标准GB16565-2003《油炸小食品卫生标准》规定，油炸类炒货大肠菌群为≤30MPN/100g，超过国家标准规定可判断为不合格炒货制品。15、果、蔬汁饮料的落菌总数标准15、依据国家强制性标准GB19297-2003《果、蔬汁饮料卫生标准》规定，果(蔬)汁及果(蔬)汁饮料产品的菌落总数不得超过100cfu/mL，酵母不得超过20cfu/mL，超过国家标准规定可判断为不合格果、蔬汁饮料。16、果冻的落菌总数标准依据国家强制性标准GB19299-2003《果冻卫生标准》规定，果冻中菌落总数≤100cfu/g、大肠菌群≤30MPN/100g，超过国家标准规定可判断为不合格果冻产品。17、黄酒的菌落总数标准依据国家强制性标准GB2758-2005《发酵酒卫生标准》规定，黄酒产品的菌落总数应≤50cfu/ml，超过国家标准规定可判断为不合格黄酒。18、芝麻酱的菌落总数标准依据国家标准规定芝麻酱产品的大肠菌群应≤90个/100g，超过国家标准规定可判断为不合格芝麻酱。19、碳酸饮料的菌落总数标准依据国家强制性标准《碳酸饮料卫生标准》规定，碳酸饮料产品的酵母应≤10cfu/mL，菌落总数应≤100cfu/mL，大肠菌群应≤6MPN/100mL；超过国家标准规定可判断为不合格碳酸饮料。20、熟肉制品的菌落总数标准强制性国家标准GB2726-2005《熟肉制品卫生标准》规定，菌落总数标准限量值为≤30000cfu/g，超过国家标准规定可判断为不合格熟肉制品。21、豆制品及面筋的菌落总数标准依据国家强制性标准GB2711-2003《非发酵性豆制品及面筋卫生标准》规定，定型包装非发酵豆制品的菌落总数为≤750cfu/g；依据国家强制性标准GB2712-2003《发酵性豆制品卫生标准》规定，定型包装发酵性豆制品的大肠菌群为≤30MPN/100g。若超过国家标准规定可判断为不合格豆制品或面筋。22、方便面的菌落总数标准依据国家强制性标准GB17400-2003《方便面卫生标准》规定，方便面的面块+调料菌落总数为≤50000cfu/g，大肠菌群为≤150MPN/100g，超过国家标准规定可判断为不合格方便面。实训二食品中大肠菌群的测定一、实验目的1．学习和掌握食品中大肠菌群的检测原理和方法，以判别食品的安全与质量优劣；2．体会大肠均群在食品安全与质量检验中的意义。二、实验说明大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的，经37℃24～48h培养能产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，同时可以推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。三、实验器材1．仪器和材料恒温培养箱（36℃）、恒温水浴（46℃）、冰箱（2～5℃）、天平、显微镜、温度计、500mL无菌锥形瓶1个（内装225mL无菌水和适量玻璃珠）、无菌培养皿（90mm）10套、1mL无菌吸管10支、10mL无菌吸管10支、50mL试管10支、无菌生理盐水200mL；火柴、载玻片、接种针、试管架、杜氏管10支。图放好倒置杜氏管的试管2．培养基及试剂月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（VioletRedBileAgar，VRBA）、磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水、无菌1mol/LNaOH、无菌1mol/LHCl、9mL乳糖胆盐发酵管12支、乳糖发酵管12支、伊红美蓝琼脂培养基（EMB）150mL、革兰氏染色液1套。四、操作步骤方法1：大肠菌群LST肉汤培养基MPN计数法图食品中大肠菌群MPN计数法检验程序1．采样及稀释（1）固体和半固体样品：称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。（2）液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。（3）样品匀液的pH值应在～之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。（4）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。（5）根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。2.乳糖初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36±1℃培养24±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。3.复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36±1℃培养48±2h，观察产气情况。产气者，为大肠菌群阳性管。4.大肠菌群最可能数（MPN）的报告根据大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（如表9-1所示），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。表9-1大肠菌群最可能数（MPN）检索表阳性管数MPN95%置信区间阳性管数MPN95%置信区间下限上限下限上限000<--2202142001221289401011222359401118230299402018231369403038300239410118302641718010211383104391801102031175172001111138312120374201201142313160404201211542320931842013016423211503742020038322210404302011442323290901000202204233024042100021015423314609020002112042332110018041002122794333>1100420--注1.本表采用3个稀释度[(mL)、(mL)和(mL)]、每个稀释度接种3管。2.表内所列检样量如改用lg(mL)、(mL)和(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用(mL)、(mL)、(mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。方法2：大肠菌群平板计数法1.大肠菌群平板计数法检验程序图大肠菌群平板计数法的检验程序2.操作步骤（1）样品的稀释。同大肠菌群MPN计数法。（2）平板计数a.选取2～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。b.及时将15～20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36±1℃培养18～24h。(3)平板菌落数的选择选取菌落数在15～150cfu之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为或更大。(4)证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36±1℃培养24～48ｈ，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。3.大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以（3）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）＝×105cfu/g（mL）。方法3：生活饮用水中大肠菌群乳糖胆盐培养基MPN计数法引自GB/T《生活饮用水标准检验法》中大肠菌群的检验，为我国大多数卫生单位和水厂所使用，食品企业检验所用水一般也采用此法。它包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。1.方法与步骤（1）采样：取100mL磨口带塞玻璃瓶，包扎后，干热灭菌备用。取自来水样时，至少应先放水5min，以冲去龙头口所带的微生物，获得主流管中有代表性的水样。取样时，用右手握瓶，左手启开瓶塞，用覆盖瓶口的纸托住瓶塞，收集样品后，连同覆盖纸一起将瓶口塞好，并用线绳在原处扎好。注意手指不得触及瓶口内部。在静水中取样时，先用右手揭去塞子，瓶口朝下浸入水下约30cm处，然后将瓶子反转过来，待水注满后，取出塞好瓶口。如果水在流动，瓶口必须迎着水流，以免手上的细菌被水冲进瓶子。水样放置过程中，内含的细菌数目和类型会发生变化，所以要求水样品应于6～10℃贮存，并不超过6h。图9-5生活饮用水中大肠菌群的检验程序（2）初发酵试验：吸取待检样品接种于乳糖蛋白胨发酵管内，10mL接种量采用双料发酵管，而lmL及lmL以下接种量采用单料管。如取10mL双料乳糖蛋白胨培养液中，取1mL水样接种到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1mL水样注入到9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取1mL注入到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管。对于已经处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接接种5份10mL水样双料培养基，每份接种10mL水样。检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种甚至，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种1mL以下水样时，必须作10倍递增稀释后，取1mL接种，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌刻度吸管。将接种管置于36士1℃培养24士2h。如所用乳糖蛋白胨培养管都不产气产酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸、产气的发酵管，按下列程序继续进行检验。（3）分离培养在指示性培养基上分离培养：将产气的发酵管中的发酵液分别接种在EMB（伊红美蓝琼脂）平板上划线分离，置于36士1℃培养18～24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作为革兰氏染色、镜检和证实试验。深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心较深的菌落。（4）证实试验革兰氏染色及镜检：于上述平板上长出的菌落中挑取1～2个大肠菌群可疑菌落进行镜检和革兰氏染色。复发酵试验：将上述镜检之菌落同时接种于乳糖蛋白胨发酵管，置于36士1℃培养18～24h，观察产气情况，有产酸产气者即证实有大肠菌群存在。（5）结果报告凡是在乳糖胆盐发酵管产酸、产气，在指示性培养基上能生长的，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，在复发酵管中产酸、产气的，即说明有大肠菌群的细菌存在—大肠菌群阳性；有一项不符的，即说明无大肠菌群的细菌存在大肠菌群阴性。根据证实为大肠杆菌群阳性的管数，查相应的大肠杆菌MPN检索表，报告每100毫升待检样品中大肠菌群细菌的最近似数。5管法结果如表9-2所示,15管法结果如表9-3所示。稀释样品查表后所得结果应乘以稀释倍数。如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告总大肠菌群未检出。表9-2用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果组合时的最可能数（MPN）5个10mL管中阳性管数最可能数（MPN）0<12345>16实验结果在纯样品发酵管中，观察到了产气、产酸现象。说明培养出了大肠菌群落。查MPN表，发现我们小组测的样品中每100ml大肠杆菌群最可能数为200个。项目三革兰氏染色实验原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由