胎儿有核细胞筛选技术概述课件

母体外周血胎儿细胞筛选背景介绍美国2006年发布的“全球出生缺陷报告〞中显示：全世界每年出生缺陷儿超过800万，90%发生在中低收入国家，每年至少有330万5岁以下儿童死于出生缺陷，约320万存活缺陷儿终生残疾。我国是世界上出生缺陷高发国家之一，全国出生缺陷总发生率约为11‰-14‰，且呈逐年上升趋势。中国每年有约2000万婴儿出生，其中约有20-30万肉眼可见先天畸形儿，加上出生后数月和数年才显现出来的缺陷，中国先天残疾儿童总数高达80-120万，约占每年出生人口总数的4％-6％。2007年全国前5位的出生缺陷疾病依次为：先天性心脏病、多指(趾)、唇裂、神经管缺陷和先天性脑积水，发生率分别为25.1/万、16.3/万、13.1/万、7.2/万和6.8/万。据统计，我国目前的出生缺陷死亡率为30%，残疾率为40%，只有30%可以治愈或纠正。如果对所有存活的出生缺陷和残疾提供治疗、康复和福利，全国每年要投入300亿元人民币。2产前诊断3产前诊断方法45母血中主要存在两种来源的胎儿细胞，一种是胎盘细胞，如合体滋养细胞和细胞滋养细胞；另一种是胎儿血细胞，如淋巴细胞、粒细胞及胎儿有核红细胞。滋养细胞是最早出现在母血中的胎儿细胞〔孕4-5周起〕，但在进行产前诊断最正确时期即孕早期时，只有极少量的滋养细胞出现在母血中。滋养细胞可以在体外培养，但其多核特征及嵌合型核型会干扰遗传学结果分析，不利于用于产前诊断。胎儿淋巴细胞于孕14周出现于母体血循环中。有学者利用HLA-A2抗原作为标记，结合FACS从孕妇外周血中别离到胎儿细胞。但由于HLA抗原系统有较高的个体特异性，且需知道父母双方的HLA类型，所以将它直接用于临床还有一定的困难。同时，由于胎儿淋巴细胞产后可持续存在于母体数年，故诊断可能受既往妊娠的影响。针对胎儿粒细胞的研究较少，可能是特异性单克隆抗体较难寻找。目前认为胎儿有核红细胞是用于产前诊断的最理想细胞类型：从孕6周至分娩持续存在于母体外周血中；每40ml母血中有100-1000个，而正常人外周血中几乎没有；在母血中生命周期较短，约为90天；属单核细胞，含有胎儿的全部遗传信息，且易从形态学上区分；表达数种特异性抗原，如转铁蛋白受体CD71，以及独特的胎儿血红蛋白ε,γ链等。母体外周血胎儿细胞外周血胎儿细胞筛选6方法原理备注FACS荧光染料标记的抗体与细胞表面特异性抗原标记物结合，然后用流式细胞仪进行分析。FACS方法可以高纯度富集、分类细胞，允许多参数分类，并适合于细胞内抗原的应用[1]。MACS使用磁珠结合特异性抗体，在外加磁场的作用下靶细胞能向一定方向移动，从而得到富集。MACS的优点是快速、批量、便宜，适合处理大量细胞时使用[1]；缺点是NRBCs纯化度较低[2]。化学富集方法7由于母体外周血中循环胎儿细胞很少，并且在富集过程中也存在丧失，故FACS和MACS方法都较难富集到胎儿细胞。方法原理备注密度梯度离心先用抗体去除外周血中母亲的白细胞成分，再进行离心，对离心后的细胞部分可进行FISH或RT-PCR来识别胎儿细胞或胎儿核酸成份。是一种简单、快速的progenitorcell富集方法。因富集的细胞不只局限于红细胞系，故可以用于胎儿细胞的体外培养。电流分离(CFS)不依赖于抗体的胎儿细胞富集方法，它根据细胞在电场和缓冲液流梯度中的迁移行为分离细胞。自动、快速，富集的细胞中约30%是胎儿细胞。CFS是否较其他方法能回收更多的胎儿细胞还在研究当中[1]。物理富集方法8方法原理备注LMPC激光微切割可以从感兴趣的细胞群或大的组织区域中切下单个细胞或亚细胞成分。微切割之后，目标直接被弹射到适当的收集装置中。实施过程中没有与细胞的机械接触，

避免交叉污染。整个过程可实现全自动(PALMMicroBeansystem)。9外周血胎儿细胞纯化InternationalJournalofMolecularMedicine.2021.21:3-12.

方法原理备注基于DEP的芯片实验室技术DEP是在不均一电场作用下粒子的运动。通过改变频率，粒子会朝向或远离高电场方向运动[7]。DEP

array由微室构成，芯片表面包括许多微位点，每个都有一个表面电极。通过电极连接，在微位点上方会形成DEPcage。一个或多个粒子可被DEPcage捕获并悬浮，并在电压调控下独立运动。通过设置DEP

cage的位置控制粒子运动，最后运动到芯片设备上的回收区域。需要考虑细胞表面的抗原-抗体作用在电泳缓冲液中是否稳定。分离后细胞活力对DNA分析不是必要，可染色体分析需考虑。目前数据表明DEP分离后细胞还具有活性，并且没有突变[1]。外周血胎儿细胞纯化InternationalJournalofMolecularMedicine.2021.21:3-12.10InternationalJournalofMolecularMedicine.2021.21:3-12.11外周血胎儿细胞分析流程12胎儿有核红细胞体外培养13NRBC特异性抗体InternationalJournalofMolecularMedicine.2021.21:3-12.14NRBC阳性筛选NRBC膜上存在对一些抗体反响阳性的抗原，可以利用这些抗体去识别NRBC。CD71：转铁蛋白受体，是一种胎儿红细胞膜抗原，在fNRBCs上高度表达。它随孕周而增高，并随着胎儿红细胞的成熟而消失，最适宜别离胎儿细胞之用。DianaWBianchi等单独利用抗CD71抗体进行fNRBCs的分选，对其分选纯度不甚满意，提出应增加另一种特异性抗体进行双标分选(PNAS.1990)。FB3-2;H3-3;2-6B/6:抗CD71单克隆抗体。PezzoloA等用MACS方法富集fNRBCs，然后通过FISH成功检测出胎儿染色体畸变(MinervaMed.1997)。2F6.3:抗CD71的鼠源单克隆抗体。分选fNRBCs效果较好，分选的胎儿细胞受母亲细胞污染少(JMaternFetalNeonatalMed.2004)。GPA(glycophorinA)：血型糖蛋白A，是在幼稚红细胞和成熟红细胞外表均表达的红细胞特异性血型抗原，在白细胞外表不表达。将CD71+/GPA+细胞作为靶细胞别离，其准确率较单一CD71抗体更高(中国优生与遗传杂志.2000)。15GPC：血型糖蛋白C，在红细胞膜中浓度较GPA低。JWChoi等用抗GPC抗体标记骨髓增生异常综合征病人的NRBC(Leukemia.2002)。Hemoglobin：在胚胎发育早期，合成胚胎血红蛋白HbGower1(ξ2ε2)、HbGower2(α2ε2)、HbPortland(ξ2γ2)；胎儿期主要是HbF(α2γ2)。γ链，从孕8w直至胎儿出生均有较高程度的表达，在孕8~10wHbF为fNRBCs的主要Hb，而成人Hb的主要成分为α2β2，因此应用HbFγ链的单克隆抗体选择胎儿细胞具有较高的敏感性(PrenatDiagn.1997)。ξ链，孕10~12w时ξ-Hb阳性细胞显著高于其他妊娠周数。Choolani等在混有男性胎儿红细胞的女性成人骨髓红细胞中证实了抗ξ-Hb单克隆抗体对于fNRBCs的高特异性，对于产前诊断是可行的(Blood.2001)。ε链，是最特异性的fNRBCs标记，而其他胎儿Hb已经被证明在成人中也存在。Morten等用phagedisplay选择ε–Hb抗体，从而增加了特异性和减少了假阳性，对于产前诊断是可行的(JBiomedBiotechnol.2021)。NRBC阳性筛选16NRBC阴性筛选阴性筛选是利用抗母体白细胞特异性抗原的抗体，从而去除母体白细胞成分。CD45：CD45抗原存在于所有白细胞上，但不存在于NRBC上。剔除CD45+细胞可以使阳性选择更有