病原微生物菌（毒）种保藏 质量控制通用标准

1病原微生物菌（毒）种保藏质量控制通用标准本文件规定了病原微生物菌（毒）种保藏过程中接收、鉴定、编目、制备、保存、复苏、对外提供、销毁等质量控制相关要求。本文件适用于病原微生物菌（毒）种保藏中心、保藏专业实验室等保藏机构，以及涉及病原微生物菌（毒）种保管和使用等单位。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27025检测和校准实验室能力的通用要求GB/T2828.1计数抽样检验程序GB/T30690小型压力蒸汽灭菌器灭菌效果监测方法和评价要求GA1802.2生物安全领域反恐怖防范要求第2部分：病原微生物菌(毒)种保藏中心SN/T4835实验室生物废弃物管理要求WS233病原微生物实验室生物安全通用准则WS315人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构设置技术规范T/CAS714（T/CAV002）预防性生物制品用病原微生物菌（毒）种低温保藏技术指南T/CPMA011病原微生物菌（毒）种保藏数据描述通则3术语和定义WS315—2010界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1病原微生物pathogenicmicroorganisms可以侵犯人体，引起人感染甚至传染病的微生物，主要包括病毒、细菌、真菌、立克次体等。3.2菌（毒）种microorganismstrain可培养的，人间传染的病毒、细菌、真菌、立克次体等具有保存价值的，经鉴定、分类并给予固定编号的病原微生物。3.3保藏collection保藏机构依法以适当的方式收集、鉴定、编目、保存菌（毒）种或样本，维持其活性和生物学特性，并向合法从事病原微生物相关实验活动的单位提供菌（毒）种或样本的活动。[来源：WS315—2010，3.2，有修改]23.4质量控制qualitycontrol满足保藏质量标准要求而进行的管理活动。3.5鉴定identification通过各种方法确定所保藏微生物的生物学特性。3.6编目catalog对菌（毒）种及其相关数据，按照一定规则进行著录，组织成目录并进行维护的过程。3.7制备prepare通过各种方法传代、培养菌（毒）种的过程。3.8保存storage储存菌（毒）种，维持其活性和生物学特性的活动。3.9复苏revival将菌（毒）种代谢活动从停止或趋于停止状态恢复到正常生理活动状态的过程。3.10销毁destroy对不具有保藏价值的菌（毒）种完全消除或毁灭的过程。4缩略语下列缩略语适用于本文件。CPE：细胞病变效应(CytopathicEffect)Ct：循环阈值(CycleThreshold)DMEM：改良的Eagle培养基(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)FBS：胎牛血清(FetalBovineSerum)MALDI-TOFMS：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assistedlaserdesorptionionization-timeofflightmassspectrometry)PS：青链霉素混合液100×(Penicillin-StreptomycinSolution)PBS：磷酸缓冲盐溶液（Phosphatebuffersaline）Q-PCR：荧光定量PCR(QuantitativeFluorescencePCR)TCID50：半数组织培养感染剂量(50%组织细胞感染量)(Fifty-percentTissueCultureInfectiveDose)5基本要求5.1人员要求5.1.1从事菌（毒）种保藏的相关人员应具有相关工作背景，具备相关知识和技能要求。5.1.2从事菌（毒）种保藏的相关人员应通过生物安全、保密等相关内容培训，签署保密协议，以及相关资格审查。5.1.3从事菌（毒）种保藏的相关人员应健康状况良好，并接受必要的健康监测和预防控制措施。5.1.4人力防范要求应符合GA1802.2—2022。5.1.5人员其他要求应符合WS315。5.2设施设备要求5.2.1菌（毒）种保藏机构设施设备应符合GB19489、WS233和WS315等有关生物安全和保藏工作3要求。5.2.2菌（毒）种保藏机构应配备备用的保藏设施设备、个人防护设备、应急消毒设备或药械。5.2.3应配备保藏相关设施设备的温度异常报警装置；如采用液氮超低温设备，应配置氧浓度监测和强排风系统。5.2.4低温保藏设备应具备应急状态下可持续工作的能力。5.3材料要求5.3.1应选择来源可靠、质量合格的细胞、培养基等实验材料。培养使用的细胞、培养基的成分配比、培养温度、pH值、离子强度、对氧需求程度，或活体培养条件等应明确，每批次用培养物质应进行阳性对照及阴性对照的质量控制。5.3.2应选择质量合格的实验耗材，并建立购置、接收、使用等管理制度。5.3.3低温保藏所用管材应具有耐低温防破裂特性，同时热胀冷缩小，管口应有特殊设计，防止低温状态下管口缝隙导致感染性材料外溢。5.4保藏方法要求5.4.1应根据菌（毒）种类别及特性，选择适宜的保藏方法，包括超低温保存法、冻干法等。5.4.2同一菌（毒）种应选用两种或两种以上方法进行保藏。5.4.3如只能采用一种保藏方法，其菌（毒）种须备份并存放于两个独立的保藏区域。5.5应急处置要求5.5.1应制定冰箱温度异常、液氮供应不足等应急处置程序，并定期进行应急演练。5.5.2应建立菌（毒）种丢失、被盗、被抢以及人员感染等意外事件的报告制度。6菌（毒）种接收要求6.1菌（毒）种提供方在申请保藏前，宜对提交保藏的菌（毒）种进行生物学、活性及稳定性评价。相关评价结果作为信息数据提供保藏机构。6.2保藏机构接收的菌（毒）种的数据描述应信息完整、真实、准确、规范，并符合T/CPMA011。6.3保藏机构在对菌（毒）种信息核对后，对菌（毒）种进行编号，可参照《病原微生物菌（毒）种保藏编号规则》并向菌（毒）种提供方提供接收证明。7菌（毒）种鉴定要求7.1生物学特征鉴定7.1.1鉴定内容应包括形态学鉴定、生理生化鉴定、质谱鉴定及分子生物学鉴定。如发现菌（毒）种与命名不符，应告知提供方，并销毁或返还。7.1.2宜鉴定菌（毒）种毒力(滴度)。7.1.3应从菌（毒）种及其亚种、型的多样性和典型特征开展鉴定。7.2活性鉴定7.2.1通过生长曲线标定、比色法、空斑实验和半数组织细胞感染剂量测定等方法明确菌（毒）种生长、繁殖活性。7.2.2应确保菌（毒）种为纯培养物。7.2.3应明确菌（毒）种代次、批号、传代时间及培养基等信息。7.3稳定性鉴定7.3.1应对菌（毒）种在特定条件下长期、稳定存活的能力开展鉴定。7.3.2应从菌（毒）种形态、染色反应、生理生化、致细胞病变效应或血清学特性等方面开展鉴定，且有检测记录。7.3.3应对每代次培养的菌(毒）种（株）分子特征和基因型特征开展稳定性鉴定，确保无突变。47.4鉴定流程细菌分离及鉴定方法与流程见附录A。病毒分离及鉴定方法与流程见附录B。真菌分离及鉴定方法与流程见附录C。8菌（毒）种编目要求8.1保藏机构应针对所保藏的病原微生物菌(毒)种建立编目制度与程序，确保编目信息及时调整、更新。8.2菌（毒）种编目信息应具有完整性、唯一性、可持续性和扩展性。8.3菌（毒）种编目的纸质版、电子版及网页版应保持一致。9菌（毒）种制备要求9.1保藏机构应建立菌（毒）种制备制度、程序与标准操作规范。9.2菌（毒）种制备过程应在相应级别的生物安全实验室内开展，同一核心工作区内不能同时制备不同种的菌（毒）种。9.3制备的菌（毒）种管上应有牢固的标签，并含有菌（毒）种名称、编号、代次（批号）、日期等信息。9.4菌（毒）种制备后应进行鉴定，保证制备的菌（毒）种与制备前一致。9.5制备过程如使用明火，应注意消防与生物安全，符合相关规定。10菌（毒）种保存要求10.1应根据菌（毒）种种类和保存要求不同，经评估后，选择合适的保存方法。10.2应建立避免保存过程中造成菌（毒）种污染的管理制度并采取相关措施。10.3应建立保存菌（毒）种所需的最低浓度、活性以及备份数量要求。10.4采用低温方式保存菌（毒）种时，应符合T/CAS714（T/CAV002）。10.5保藏机构应建立菌（毒）种种子库，并分类保存菌（毒）种。10.6应定期对菌（毒）种抽检核查，建立程序确保菌（毒）种质量与效果。11菌（毒）种复苏要求11.1应根据菌（毒）种的生长特性和保存方法建立相应的复苏方法与程序。11.2应制定抽检原则与标准，并符合GB/T2828.1-2012。11.3应制定菌（毒）种复苏抽检的程序及方法要求。11.4应制定菌（毒）种复苏前抽检频率与周期。11.5应填写复苏记录表，包括但不限于复苏日期、复苏人、菌（毒）种编号、名称、代次、批次、数量等信息。12菌（毒）种对外提供要求12.1保藏机构应按照高致病性与非高致病性病原微生物菌（毒）种或样本分别建立对外提供菌（毒）种程序，对申请单位提交的材料进行符合性审查。12.2保藏机构应重点审核申请单位提交的证明材料，包括但不限于下列内容:a)实验室所属法人机构的法人资格证书。b)实验室生物安全认可证书或实验室备案证明材料，以及实验活动批复文件等材料。c)菌（毒）种的使用目的、用途、销毁措施等。12.3保藏机构对外提供时，应与使用单位签订对外提供协议书，并附菌（毒）种数据信息。513菌（毒）种销毁要求13.1保藏机构和菌（毒）种使用单位应按照菌（毒）种不同危害程度的审批权限，建立菌（毒）种销毁程序。13.2保藏机构应建立可销毁菌（毒）种的范围，包括但不限于：a)传代、复苏、抽检过程中产生的质量不合格菌（毒）种。b)存在污染、变异或活力异常的菌（毒）种。c)无保藏价值的菌（毒）种。13.3保藏机构或菌（毒）种使用单位应使用经验证、可靠的技术方法销毁菌（毒）种。13.4销毁后的菌（毒）种应按照医疗废物处理，并符合SN/T4835-2017及其他有关要求。13.5保藏机构应建立菌（毒）种销毁登记制度，记录文件参见附录D。6（规范性）细菌分离及鉴定方法与流程A.1分离培养基的选择A.1.1总体要求选择适当的分离培养基是细菌分离培养中关键的一环，采集的标本送往细菌实验室后，根据标本来源、培养目的、分离的目的菌种类等，应立即接种到适当的分离培养基上。A.1.2培养基种类A.1.2.1血平板:适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都可接种此平板。A.1.2.2巧克力血平板:其中含有V和X因子，适于接种怀疑含有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。A.1.2.3中国蓝平板或伊红美蓝平板:可抑制革兰阳性细菌，有选择地促进革兰阴性细菌生长，是较好的弱选择性培养基。发酵型革兰阴性杆菌因分解乳糖能力不同，在此平板上菌落颜色不同，便于鉴别菌种。A.1.2.4麦康凯平板:具中等强度选择性，抑菌力略强，有少数革兰阴性菌不生长。在麦康凯平板上能否生长，是不发酵菌鉴定的一个依据。A.1.2.5SS琼脂:有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。因选择性过强，可影响检出率，所以，使用时最好加一种弱选择平板以配对互补。A.1.2.6碱性琼脂或TCBS琼脂:用于分离霍乱弧菌及其他弧菌。A.1.2.7血液增菌培养基:用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。A.1.2.8营养肉汤:用于标本及各类细菌的增菌培养。A.2细菌的培养条件A.2.1总体要求细菌的生长繁殖需要提供合适的环境条件,不同种类的细菌，生长繁殖的条件不完全相同，个别种类细菌要求特殊的环境条件。但其基本环境条件包括酸碱度、温度、气体、渗透压等方面。A.2.2具体要求A.2.2.1酸碱度a)大多数细菌最适的酸碱度为pH7.2～7.6，在此pH下,细菌的酶活性强，生长繁殖旺盛。b)个别细菌如霍乱弧菌在pH8.4～9.2的碱性条件下生长最好。c)结核分枝杆菌在pH6.5～6.8最适宜。d)细菌代谢过程中分解糖类产生酸，pH下降，不利于细菌生长。A.2.2.2温度a)大多数细菌生长最适温度为37℃。b)个别细菌如鼠疫杆菌在28℃~30℃的条件下生长最好。c)嗜热菌能在50℃~60℃下生长，海洋细菌嗜低温,可在0℃~30℃条件下生长。A.2.2.3气体a)多数细菌在代谢过程中需要二氧化碳，但分解糖类产生的二氧化碳已足够所需，且空气中还有微量二氧化碳，不必额外补充。b)少数细菌如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等在初次分离培养时,必须供给5%～10%的二氧化碳才能生长。7A.2.2.4渗透压a)一般培养基的盐浓度和渗透压对大多数细菌是安全的。b)少数细菌如嗜盐菌需要在高浓度的氯化钠（3%）环境中生长良好。A.3细菌的鉴定A.3.1形态学鉴定取液体培养的细菌10微升，用生理盐水稀释不同浓度，显微镜下观察单个细菌的大小、形状、运动性、鞭毛等。A.3.2革兰染色鉴定革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法如下：a)制片取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。要用活跃生长期培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。b)初染：滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1min～2min，水洗。c)媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。d)脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。乙醇脱色是革兰染色操作的关键环节：脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。因而脱色时间一般为20s～30s。e)复染：用番红液复染约2min，水洗。f)镜检：干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰阳性菌，被染成红色的为革兰阴性A.3.3细菌的生理化学鉴定A.3.3.1糖(醇)类发酵试验在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌名和组号。取葡萄糖发酵培养基3支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。同样取3支乳糖发酵培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。将已接种好的培养基置32℃温箱中培养24h。A.3.3.2甲基红试验(M.R.试验)将大肠杆菌和产气杆菌分别接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，32℃培养24h，加甲基红指示剂数滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。A.3.3.3伏-普试验(V-P试验)将被检菌接种到葡萄糖蛋白胨水中，32℃培养24h，取出，加入40%KOH7滴，然后再加入等量的5%α-萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃温箱中保温30min，以加快反应速度。若培养物呈现红色，为伏-普反应阳性。A.3.3.4靛基质(吲哚)试验将被检菌接种到胰蛋白胨水培养基中，32℃培养24h后，滴加数滴吲哚试剂于培养物液面，轻轻摇动，观察结果。出现红色者为阳性，出现黄色者为阴性。A.3.3.5硫化氢试验将大肠杆菌和变形杆菌以接种针穿刺接种到醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基中，32℃培养24h，观察结果，若有黑色出现者为阳性。A.3.3.6明胶液化试验8取大肠杆菌和枯草杆菌的纯培养物少许，以接种针分别穿刺接种到营养明胶培养基中，置32℃培养24小时。故观察结果时，应将明胶培养基轻轻放入4℃冰箱30min，此时明胶又凝固。若放置于冰箱30min仍不凝固者，说明明胶被试验细菌液化，是为阳性。A.3.3.7柠檬酸盐利用试验取少量被检菌接种到柠檬酸盐培养基上，32℃培养24h后，观察结果。培养基变深蓝色者为阳性。A.3.3.8淀粉水解试验在培养进表面滴加碘液，观察是否变紫。结果判定见表A.1细菌生理化学鉴定结果判定表。表A.1细菌生理化学鉴定结果判定表A.3.4血清学鉴定A.3.4.1取清洁玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明号码。无菌操作下，用接种环于1、2格内加1∶10稀释诊断血清1～2滴，第三格加1～2滴生理盐水。A.3.4.2无菌操作下，用接种环取伤寒杆菌培养物少许，混于第三格中，再混于第一格中（不能先混第一格再混第三格，因为这样将使诊断血清混入盐水而影响对照结果将细菌与盐水或血清混合均匀使呈乳状液。此时取菌量不可过多，使悬液呈轻度乳浊即可。A.3.4.3同法取痢疾杆菌培养物少许，于第二格内混匀。A.3.4.4轻轻摇动玻片，经1min～2min后肉眼观察，出现乳白色凝集块者，即为阳性反应；仍为平等的乳浊液者，即为阴性反应。如结果不够清晰，可将玻片放于低倍显微镜下观察。A.3.5质谱图谱鉴定A.3.5.1微生物培养：将微生物按照其适宜的生长条件培养至生长对数后期，常见细菌和酵母一般培养24-48小时，用无菌接种环挑取5mg～10mg新鲜的菌体于1.5ml离心管中，加入300μl无菌水充分悬浮，加入900μl无水乙醇，用涡旋振荡器震荡均匀，12000rpm离心2min～3min，弃上清后再次离心，用移液枪小心去除残余上清液，室温下干燥沉淀5分钟（乙醇挥发干即可）。A.3.5.2基质配制：称取15mgα-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）于1.5ml心管中，加入1ml基质溶剂9（乙腈：水：三氟乙酸＝20：19：1，v/v/v),充分涡旋混匀，可置于4℃保存（注意，使用前应再次混匀，后静置1min即可）。A.3.5.3点样：提取样1ul样品点至靶点中心，自然晾干后，再滴加1μl基质溶液上清覆盖样品，自然晾干，置于真空干燥靶箱中数秒即可。仪器参数设置为质量范围2000Da～20000Da，釆用337nm氮气激光器，脉冲延时450ns，靶高压19000V,脉冲高压1800V，MCP电压1480V，透镜高压2000V，激光能量3vJ～6vJ，激光频率60Hz，单张谱图累加300次。A.3.5.4将采集到的指纹图谱与建立的标准指纹图谱库进行检索比对，完成微生物的分类鉴定。A.3.616SrRNA基因细菌菌种鉴定A.3.6.1设计引物，一般使用16SrRNA通用引物序列1492R/F27，不同的种群有不同的引物，根据判断使用合适的引物序列。A.3.6.2取新鲜培养的细菌一个菌落或是1l菌液作为模板，常规反应体系和反应条件即可。A.3.6.3扩增结束后用1%的琼脂糖凝胶电泳，检测条带的大小。经切胶回收后测序。A.3.6.4通用的五种16SrRNA基因PCR扩增引物见表A.2。表A.2通用的五种16SrRNA基因PCR扩增引物适用范围fD1ccgaattcgtcgacaacAGAGTTTGATCCTGGCTCAC大多数真细菌fD2ccgaattcgtcgacaacAGAGTTTGATCATGGCTCAC肠道细菌及其相关细菌fD3ccgaattcgtcgacaacAGAGTTTGATCCTGGCTTAGSpirochetes疏螺旋体fD4ccgaattcgtcgacaacAGAATTTGATCTTGGTTCAG衣原体属rP1cccgggatccaagcttACGGTTACCTTGTTACGACTT肠道细菌A.3.7MLST鉴定直接从MLST数据库(/)中获取分型方案，设计引物，用提取的基因组为模板，PCR扩增，采用一代或二代测序方法开展细菌MLST分型，测序结果直接在网站(/)比对。A.3.8基因组鉴定提取细菌基因组DNA后，随机打断进行电泳回收，加上接头后进行DNA簇（Cluster）制备，最后利用Paired-End（Solexa）或者Mate-Pair（SOLiD）的方法对插入片段进行测序。然后对测得的序列组装成Contig，通过Paired-End的距离可进一步组装成scaffold，进而组装成染色体。基因组数字DNA-DNA杂交(dDDH)，70％的阈值，当测试菌株基因组与某个模式菌株基因组dDDH>70%，则测试菌株基因组与该模式菌株属于同一物种。平均核苷酸相似性(ANI)表示两个基因组共享的同源基因组之间的平均值,95-96％的ANI值等同于70％的DDH值，可以代替DDH作为物种划分的边界。固体培养基划线返回待测菌株，核实基因组测定生化鉴定革兰氏染色菌体镜下形态固体培养基划线返回待测菌株，核实基因组测定生化鉴定革兰氏染色菌体镜下形态A.4细菌鉴定流程细菌鉴定流程见图A.1。取待鉴定细菌菌株，核对菌株基本信息接种液体培养基培养基浑浊液体培养基澄清培养基浑浊挑取单克隆菌落，接种液体培养基确定细菌的种属图A.1细菌鉴定流程（规范性）病毒分离及鉴定方法与流程B.1病毒接种B.1.1根据病毒种类的不同，选用不同敏感细胞系或鸡胚接种。样本接种前一天将细胞传至24孔细胞培养板，次日细胞应至60%~70%丰度。B.1.1.1将待测毒种按1：10、1:100、1:1000倍稀释，稀释后的病毒100µL接种细胞板。B.1.1.2置于不同病毒孵育的温度（33℃或37℃)、5%CO2培养箱吸附培养。B.1.1.3设置正常细胞作为对照。B.1.2观察CPEa)按上述方法将样本接种细胞后，每24h在倒置显微镜下观察CPE,CPE表现为细胞肿胀、变圆、脱落等。b)以0%～25%细胞CPE变化为“+”;c)26%～50%细胞CPE变化为“++”;d)51%～75%细胞CPE变化为“+++”;e)76%～100%细胞CPE变化为“++++”;f)正常细胞形态为“-”。B.1.3记录显微镜下观察至第5d～7d，当细胞出现CPE后，将细胞培养板置于-80℃冰箱冻融两次，将细胞培养上清于4℃、450g离心10min，离心后的上清液分装于冻存管中，并记录病毒名称、代次、敏感细胞、日期、操作人等信息。如无CPE出现，直接吸取上清（不应冻化）进行盲传。盲传2代后无CPE出现，确定病毒结果为阴性。B.2病毒鉴定方法B.2.1采用标准终点稀释法测定病毒滴度TCID50B.2.1.1根据毒种确定细胞系，按相应细胞数传至96孔板，次日细胞应至60%～70%丰度；次日，用病毒孵育液将病毒进行10倍系列稀释，10-1～10-8共八个稀释度TCID50，并设复孔。B.2.1.2弃细胞培养液，用不含血清的DMEM培养基清洗细胞两遍，将系列稀释的病毒接种到细胞上，置37℃、5%CO2培养箱孵育1h，设阴性对照。B.2.1.3每孔加入100µL病毒维持液，置33℃或37℃、5%CO2培养箱培养5d～7d。B.2.1.4倒置显微镜下观察CPE，计数病变孔与非病变孔，计算TCID50。以观察该孔是否出现CPE确定该孔是否为阳性孔，假如某个梯度8个孔中共有6个阳性孔，则将该梯度的结果记为6/8，依次类推。B.2.1.5计算病毒TCID50，用Reed-Muench公式计算病毒滴度。Reed-Muench计算公式TCID50＝高于50%死亡率的病毒稀释度的对数+距离比值×稀释倍数（10）的对数。距离比值=（高于50%的百分数-50%）/（高于50%的百分数-低于50%的百分数）。B.2.2病毒空斑测定B.2.2.1将相应细胞浓度铺至12孔板，次日细胞应至60%～70%丰度。B.2.2.2次日，用病毒孵育液将病毒进行10倍系列稀释。B.2.2.3弃细胞培养液，用不含血清的DMEM培养基清洗细胞两遍。B.2.2.4将稀释的病毒液取400μL接种到细胞上。置37℃、5%CO2培养箱孵育1h。B.2.2.5弃病毒孵育液，用不含血清的DMEM培养基（1ml/孔）清洗细胞两遍。B.2.2.6微波炉加热融化2%低熔点琼脂糖后置37℃水浴中，37℃温育2×DMEM高糖培养基。B.2.2.71:1混合2%低熔点琼脂糖和2×DMEM，然后将混合液1.5mL/孔加于12孔板。B.2.2.8安全柜内室温放置30min，凝固后倒置于37℃、5%CO2培养箱中72h。B.2.2.9加入8%多聚甲醛1mL/孔（多聚甲醛的终浓度为4%室温固定2h，B.2.2.10用枪弃掉固定混合液，并用PBS清洗。1%结晶紫（200μL/孔）室温染色10min。小心弃掉结晶紫，并用PBS清洗两遍，在室温下晾干。拍照并计算空斑形成单位。B.2.3血球凝集实验B.2.3.1将96孔板自左至右加入50µL/孔生理盐水。B.2.3.2左侧第一孔50µL病毒液（尿囊液混匀后吸50µL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50µL。第12孔为红细胞对照。B.2.3.3向各孔加入0.5%鸡红细胞悬液50µL，室温下静置30～45min后观察结果病毒的最高稀释度为血凝效价，该管稀释度即为1个血凝单位，表示如下：a)“++++”：完全凝集，凝集的红细胞铺满管底；b)“+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜，边缘有下垂趋势；c)“++”：凝集，约半数红细胞沉积于管底呈环状；d)“+”：微量凝集，少数红细胞沉于管底，呈边缘不清晰的圆盘状；e)“-”：不凝集。红细胞沉于管底，呈边缘整齐的圆盘状。B.2.4分子生物学鉴定B.2.4.1靶基因扩增及测序B.病毒核酸提取应根据商品化一步法Q-PCR试剂盒说明书进行。B.引物和探针序列合成病毒相应的引物和探针序列。B.反应体系及反应条件应根据商品化一步法RT-PCR试剂盒说明书进行。B.结果判定a)阴性，无扩增曲线，或Ct≥40。b)阳性，Ct<35且具典型的“S”型扩增曲线。c)可疑阳性，具有典型“S”型扩增曲线，但Ct在35~40之间，需重复试验确证。若重复试验Ct值<35，具有典型的“S”型扩增曲线，该样本判断为阳性，否则为阴性。B.2.4.2测序PCR产物可送经评估技术成熟的生物测序公司进行序列测定，从生物公司返回的序列资料，以标准的图形文件（.ab1）保存，序列整理使用相关序列分析软件分别对序列进行编辑和分析。B.2.4.3宏基因组测序B.试剂与操作使用商品化试剂盒严格按照操作说明书以及生物安全防护进行核酸提取、标本前处理、文库构建等。B.文库质检文库完成后采用荧光染料法检测浓度，同时通过荧光PCR法检测文库中有效连接接头的片段浓度。建库后文库的浓度应不低于测序平台上机要求的最低浓度。冻融2次，培养上清接种敏感细胞，盲传三代有冻融2次，培养上清接种敏感细胞，盲传三代有CPE阴性样本放弃B.文库测序上机前根据不同测序平台的要求对文库进行稀释。用高通量测序仪对构建的文库进行测序，操作符合测序仪生产企业的要求。建议单个标本测序数据量宜不低于20兆读序数。序列的单端读长不少于50bp。B.数据处理将下机数据进行无效序列和重复序列的过滤，单个标本的数据拆分后，基于参比数据库开展病原分析，形成报告。B.结果判定应确认内部质控正常，宏基因组测序阳性结果可开展病毒基因组序列分析。B.3病毒鉴定流程病毒鉴定流程见图B.1。 取待鉴定病毒毒株，核对毒株基本信息接种敏感细胞有CPE无有CPE上清4℃、2000g离心10min分装保存无CPE用生长敏感细胞的T25培养瓶扩增病毒核酸提取 RT-PCR扩增相应功能区基因PCR产物进行序列测定确定病毒的所属的种和基因型图B.1病毒鉴定流程（规范性）真菌分离及鉴定方法与流程C.1形态学鉴定C.1.1酵母菌及酵母样真菌：接种于SDA、YPD、Leeming-Notman、BHI、柯马嘉显色培养基等固体培养基上，观察其菌落形态。同时采用结晶紫染色、墨汁染色等方法，对镜下形态如假菌丝、芽生孢子、酵母样细胞等进行观察描述。C.1.2丝状真菌及奴卡菌：接种于PDA、SDA、MEA等固体平板