一种快速、特异性、快速检测登革型病毒sybrmaer-2方法的建立

一种快速、特异性、快速检测登革型病毒sybrmaer-2方法的建立

登陆热（df）是登陆病毒引起的。这是一种重要的热带和亚热带害虫传播疾病。该病主要通过埃及伊蚊(Aedesaegytpi)和白蚊伊蚊(Aedesalbopitus)传播,全世界每年约有5000万～1亿登革病毒新发感染病例,传播范围遍及亚洲、非洲和南美洲的100多个国家。在我国,登革热属于输入性疾病,曾在广东、广西、云南、台湾、香港、澳门等地发生过不同程度的流行。随着旅游业的发展、人口流动性增大以及全球气候变暖等因素的影响,蚊传疾病肆虐,严重威胁着热带和亚热带地区人民的身体健康。登革病毒有DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4等4个血清型,其中DENV-2传播最为广泛,流行最为频繁和严重。登革病毒感染者缺乏特征性临床症状,临床诊断主要依赖于实验室检查,主要有血清学和分子生物学方法。在病毒感染的早期,机体还未产生相应的抗体,不适合进行血清学检测。采用高度特异性的RT-PCR和荧光定量PCR方法检测急性期血清样品,具有特异性强、敏感性高、简便快速等特点。本研究利用DENV-2特异性保守区设计引物,建立SYBRGreenⅠqRT-PCR,通过对DENV-2及其他相关病毒的检测,评价试验的特异性、敏感性和重复性,通过Sanger测序进行验证,并对4份DENV-2RT-PCR阳性血清和10份阴性血清进行检测。材料和方法1材料表面1.1病毒病毒属genusbv和流感病毒,包括病毒、拉沙病毒、黄热病毒DENV-1Hawaii株(GenBank序列号:EU848545)、DENV-2NewGuineaC株(GenBank序列号为AF038403)、DENV-3H87株(GenBank序列号:M93130)、DENV-4H241株(GenBank序列号:AY947539)、A型流感病毒、拉沙病毒和黄热病毒,均为瑞典国家传染病控制研究所生物安全三级实验室保存。1.2血清2005年由瑞典国家传染病研究所利用RT-PCR诊断登革Ⅱ型病毒感染的人血清14份,其中4份阳性,10份阴性。1.3astermatch、选取、融资试剂、SuperscriptⅢ反转录试剂盒,美国Invitrogen公司产品;QIAampMinEluteViralSpin试剂盒,荷兰Qiagen公司产品;2×SYBRGreenMasterMix、BigDye•Terminatorv1.1CycleSequencing试剂盒、BigDye•XTerminatorTM纯化试剂盒、BigDye•XTerminatorTMPurificationKit和VeritiTM96-wellFastplate,美国AppliedBiosystems公司产品。PCR9800system、ABIPRISM7500、7900HTSequenceDetectionSystem和ABIPrism3130xlGeneticAnalyzer测序仪,美国AppliedBiosystems公司生产。2方法2.1病毒培养4个血清型登革病毒、A型流感病毒、拉沙病毒和黄热病毒均在Vero细胞上进行培养。2.2两种水相的脱盐效果将5μl病毒细胞培养上清与120μl健康血清混合,按TrizolLSReagent说明书提取RNA。取200μlRNA水相,采用QIAampMinEluteViralSpinKit进一步提纯,并以30μl的洗脱液溶解。另提取未混合病毒的健康人血清RNA,转移200μl或400μl血清RNA水相于同一过滤柱1次或2次,分别获得正常浓度或2倍浓缩的人血清RNA。所有提取的病毒RNA小体积分装,-60℃保存备用。2.3引用材料的设计与合成2.4lnase-/分质机关系作用将A液(内含500μmol/LdNTP、167μmol/L随机引物、5.33μlRNase-free水和5μl提取的RNA)分别置65℃和4℃5min后,加入7μlB液(含有1μlSuerscriptⅢ、1μlRNaseOUT、1μlDTT和4μl5×缓冲液),再分别以50℃和55℃作用30min。2.5denv-2ysbrgrenqt-pcr反应条件的优化2.5.1反应温度的影响12.5μl2×SYBRGreenMasterMix,20nmol/LD2St-F和D2St-R的混合物(D2St)和5μlcDNA,最后用DEPC水补足至25μl。反应条件:50℃2min,95℃10min;95℃变性15s,分别以不同的温度(60、61、62、63或64℃)退火60s,共40个循环。熔解曲线分析:95℃15s、60℃1min和95℃15s。每个模板至少做2个重复。扩增反应在ABIPRISM7500/7900RealtimePCRSystem上进行。用SDSv1.3.1软件分析扩增结果,并采用软件自动分析程序获得阈值(threshold)和阈值循环数(Ct)。2.5.2denv-2cda的检测选择不同浓度的上游引物(D2St-F)和下游引物(D2St-R),分别对5倍梯度稀释的DENV-2cDNA进行定量分析(采用2.5.1选择的退火温度),每个稀释度做3个重复,并以健康人血清RNA作为对照。2.6血清rna的检测以18SF/R和28SF/R作为引物,利用常规SYBRGreenⅠqRT-PCR程序对健康人血清RNA样品中的18SrRNA和28SrRNA进行定量。2.7denv-2sybr-pcr检测以其他3个血清型的登革病毒、A型流感病毒、拉沙病毒和黄热病毒RNA作为阴性对照(NC),以健康人血清RNA作为血清对照(SC)进行DENV-2SYBRGreenⅠqRT-PCR,观察试验的特异性。2.8血清标准血清中na将DENV-2RNA与2倍浓缩的人血清RNA按1∶1的比例混合,制备含320、80、20、5个拷贝/μl的标准血清样品,利用D2StqRT-PCR系统进行检测。2.9合成cdna的检测以2个不同稀释度的DENV-2RNA为模板合成cDNA,每个浓度分2个样品同时检测,观察组内重复性;每个样品的cDNA产物重复2次qRT-PCR定量分析,观察组间重复性。2.10循环序列分析将特异性和敏感性试验的D2StqRT-PCR产物稀释10倍,作为Sanger测序的模板,验证qRT-PCR检测结果。主要步骤:以D2St-F作为测序引物,使用BigDye•Terminatorv1.1CycleSequencing试剂盒对测序模板进行循环扩增,循环参数为:96℃预变性1min;96℃0s、50℃0s、60℃延伸30s,共25个循环。使用BigDye•TerminatorTMPurification试剂盒对扩增产物进行纯化,然后在ABIPrism3130xlGeneticAnalyzer仪中进行Sanger测序,利用SequenceScannerV1.0软件对测序结果进行分析,包括可读序列的信号强度、序列长度(读长)以及背景信号的影响等。将有效读长的序列放入GenBank国际数据库系统,进行BLAST分析,并利用MegAlign软件与4个血清型登革病毒的一致序列进行比较。2.11denv-2sybr-pcr检测DENV-2RT-PCR阳性血清4份,阴性10份,采用新建的DENV-2SYBRGreenⅠqRT-PCR方法进行检测,以健康人血清RNA作为阴性对照。结果1denv-2ysbrgrenqt-pcr反应条件的优化1.1特异性熔解峰的确定当退火温度为64℃时,经D2StqRT-PCR扩增获得的熔解曲线最佳,无非特异性熔解峰出现,仅在79℃左右有一个特异性的熔解峰(图1)。因此选择64℃的退火温度进行D2StqRT-PCR。1.2循环阈值相关值的分析将提取的DENV-2RNA进行连续5倍递增稀释,以不同的引物浓度进行D2StqRT-PCR反应,得出的4条标准曲线的相关数据见表1。模板的拷贝数与循环阈值(Ct)的相关值(R2)均大于0.99,呈线性关系,其中D1St-F/D1St-R的浓度比例为10nmol/L/10nmol/L时,斜率(Slope)为-3.56,扩增效率最高,为91%,对应的扩增曲线与标准曲线见图2、3。初始模板cDNA获得的平均Ct值为10.7,在PCR反应中的含量为1.7×108个拷贝[(1+0.91)(40-10.7)]。血清RNA对照未检测到任何扩增信号。2熔解峰和ct值利用18S和28SrRNASYBRGreenⅠqRT-PCR定量分析健康人血清中的18SrRNA和28SrRNA,均被特异性扩增,熔解峰分别出现在81℃和78.6℃左右,平均Ct值分别为18.3和17.0。而2倍浓缩的健康人血清中的18SrRNA和28SrRNA获得的平均Ct值分别为17.5和16.2,与健康人血清RNA获得的Ct值相差大约1个Ct,恰好是2倍浓缩后的浓度,与预期结果相符,所以2倍浓缩的健康人血清RNA可以按照1∶1的比例与病毒RNA混合,从而使标准血清中含有正常浓度的人血清RNA。3pcr特异性检测对DENV-1、DENV-3、DENV-4、A型流感病毒、拉沙病毒、黄热病毒及健康人血清RNA进行D2StqRT-PCR检测,均没有交叉反应,说明该方法特异性良好。4pcr检测ct值含320、80、20和5个拷贝/μl的DENV-2血清样品进行D2StqRT-PCR检测,获得的扩增曲线见图4,获得的Ct值见表2。随着模板拷贝数的减少,Ct值逐渐升高,但当模板浓度为5个拷贝/μl时,未检测到荧光信号。即该方法的敏感性为20个拷贝/μlRNA,相当于25个拷贝/反应,或5个拷贝/μl血清。5相似样品的检测经D2StqRT-PCR定量分析,相同样品浓度的2份样品或同一样品的2次重复检测均获得相似的Ct值,扩增曲线各自重合(图5)。6假阴性序列和假阴性序列对特异性和敏感性检测的qRT-PCR产物进行Sanger测序,所有特异性检测的qRT-PCR产物均未获得可读的序列,则特异性检测结果正确,不是假阴性结果;敏感性检测的扩增产物中,除以5个拷贝/μlRNA为模板的qRT-PCR产物未检测到测序信号外,其他阳性扩增产物都获得了可读的序列(表2),经BLAST分析,与实验室标准株DENV-2NewGuineaC的一致率均在93%以上,则敏感性检测结果正确,不是假阳性结果。7s1stqlt-pcr检测结果DENV-2RT-PCR阳性血清4份,阴性血清10份,应用D2StqRT-PCR检测结果一致。阳性样品扩增产物的Ct值见表2,对应的扩增曲线见图6,健康人血清RNA对照未检测到任何荧光信号。denv-2sybr-pcr扩增检测在常规实验室诊断方法中,病毒分离鉴定是诊断登革热的金标准,然而病毒分离培养费时、敏感性低,因此达不到早期快速检测的目的。血清学诊断因抗登革病毒的抗体与其他黄病毒存在广泛的交叉反应而受到干扰,不宜用于早期感染的诊断,但可鉴别登革病毒的初次与再次感染,因为感染一种血清型登革病毒的患者康复后还可能再次感染其他的血清型。近年来,随着分子生物学的快速发展,PCR技术得到广泛应用,特别是荧光定量PCR已经逐渐取代病毒的分离培养,成为病毒鉴定新的金标准。目前,国外对登革病毒检测方面的研究较为全面,如登革病毒的鉴定和分型、区分初次和再次感染。我国主要利用巢式PCR、SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR、TagMan荧光RT-PCR等方法进行登革病毒的检测及分型。本研究建立的DENV-2SYBRGreenⅠqRT-PCR特异性检测方法。在试验设计方面,通过对发表的登革病毒核苷酸序列的大量分析比对,设计了DENV-2特异性的引物,可用于目前所有DENV-2毒株的检测。在检测试验的敏感性时,由于标准株病毒RNA含量非常高,需要进行7个数量级左右的稀释才能得到低拷贝的RNA样品,样品中的人RNA含量也被稀释。因此,本实验在低拷贝的RNA样品中等体积混合了2倍浓缩的人血清RNA,这样标准血清样品中含有了正常水平的背景RNA,从而使该方法的敏感性试验更加接近实际血清样品的检测。在优化的扩增反应条件下,测得试验的敏感性为20个拷贝/μlRNA(或25个拷贝/反应),比Gurukumar等利用TagManMGB探针检测登革病毒得出的10个拷贝/反应的敏感性略低,但比Yong等利用S