抗体依赖性感染增强作用在登革病毒致病机制中的作用

抗体依赖性感染增强作用在登革病毒致病机制中的作用

病毒登格病毒（denv）属于黄毒科黄色病毒，具有传染性膜黄色病毒。依据血清型差异可分为1～4型登革病毒。登革病毒能在人群中引发从轻微的发热反应、登革热到危及生命的登革出血热以及登革热休克综合征等一系列症状。目前,全球每年有100多个国家和地区的5000万～1亿人感染登革病毒,发病人群主要集中在亚洲、非洲及南美洲等热带及亚热带地区,其中登革出血热和登革热休克综合征是威胁生命的急性毛细血管渗漏综合征,发病人数已接近50万,在一些地区患病儿童的死亡率高达5%。近年来,随着全球气候变暖,登革热在世界范围内的频繁暴发,尤其在东南亚以及我国南部和东南沿海地区其发病率及病死率急剧上升。登革病毒主要通过埃及伊蚊叮咬,经宿主树突状细胞的特异性黏附受体树突状细胞特异性C型凝集素(DC-SIGN)感染细胞,诱发机体产生一系列体液和细胞免疫反应。临床发现,登革出血热和登革热休克综合征集中发生于再次感染异型登革病毒的人群中,同时携带母源性IgG登革抗体的婴儿在初次感染登革病毒时也极易发病。1964年,Hawkes等首次在虫媒病毒中提出了“抗体依赖性感染增强”(antibody-dependentenhancement,ADE)假说,表现为病毒在低浓度免疫血清中的复制被促进而不被抑制,提示了ADE是登革出血热和登革热休克综合征产生的主要因素。目前认为所有登革病毒的中和抗体在一定的低浓度水平均有ADE,且异源抗体比同源抗体更易诱发ADE,尤其是第一次感染登革2型病毒时更容易产生ADE现象。1977年,Halstead等通过体外实验证明了登革病毒的ADE现象,同时将恒河猴用稀释的人抗登革4型血清免疫后再次感染登革2型病毒,发现免疫组动物血清中的病毒滴度是未免疫组的50倍。恒河幼猴用稀释的黑猩猩抗登革病毒抗体免疫后使其感染登革4型病毒,免疫组在感染5～6d后血清中病毒滴度达到峰值,是未免疫组的100倍,与临床登革出血热患者的病症一致。Balsitis等发现高剂量抗体免疫AG129小鼠后感染登革病毒后病毒血症消失,低剂量抗体免疫小鼠后有ADE现象产生,并首次建立了登革病毒ADE研究的小动物模型。研究发现,ADE不仅存在于黄病毒中,在人免疫缺陷病毒、肠道病毒71型、埃博拉病毒、流感病毒等冠状病毒和逆转录病毒的相关体外实验中也存在。这些病毒的共性包括可在巨噬细胞内复制增殖、能诱导产生大量针对同源病毒的次中和抗体,引发持续感染并有持久的病毒血症等。1病毒对抗机制1.1关于fc-fcp的检测1981年Peiris等通过西尼罗病毒首次探讨了ADE的FcR途径,即病毒初次感染时机体产生的中和抗体在较低浓度水平就可以有效介导再次感染时病毒与免疫细胞的融合形成的免疫复合物,通过抗体Fc段与靶细胞表面的Fc受体结合,增强细胞对病毒的摄入,导致感染增强。Brown等将靶细胞表面的Fc受体用单抗封闭,观察到在病毒-抗体复合物存在下检测到病毒滴度比未封闭前明显降低。不同型别的Fc受体对ADE作用也有选择性,FcγRⅡ比FcRⅠ更容易介导ADE,FcRⅡa能够介导成熟树突状细胞的ADE,而FcRⅡb无此作用。用单抗封闭细胞的FcγRⅡa后ADE现象消失,单抗的F(ab)2段也不显示ADE作用。目前普遍认为IgG抗体介导病毒与宿主细胞表面FcR的结合。Balsitis等对登革病毒单克隆抗体IgG1的297位谷氨酸进行结构改造,使抗体失去Fc结合活性,发现改造后的抗体丧失了登革2型病毒的感染增强能力。Halstead等从猴抗登革血清中分离出IgG和IgM抗体,发现只有IgG能介导ADE,而IgM对病毒完全中和。切除单克隆抗体IgGN端Fc受体结合位点处的9个氨基酸(第231～239位氨基酸),可使ADE现象消失而不影响抗体的体外中和活性[4。登革2型和4型病毒E蛋白的IgG1、IgG2a和IgG2b单克隆抗体也能增强登革病毒对FcR+细胞的感染作用,而其他亚型抗体(IgA、IgD、IgE)对ADE的影响尚未见报道。1.2其他补体受压病1983年Cardosa等发现西尼罗病毒在FCR+细胞中产生的ADE可以被CR3的单抗封闭,但不可以被FcR的单抗封闭。在病毒-抗体复合物中,抗体的Fc段同补体C1结合,启动经典途径激活C3,C3可以共价结合到抗体或病毒表面,同时识别细胞表面补体受体,形成病毒-抗体-补体复合物,在病毒和靶细胞间起到了桥梁作用,促进病毒内化和感染增强。关于ADE的补体途径还有另外两种假说:一是补体C1q结合病毒表面蛋白识别细胞表面C1q受体,促进病毒同细胞的结合;二是通过CR作用增加病毒与靶细胞表面的病毒受体结合概率。登革病毒特异的IgG亚群对登革出血热的发病起重要的作用。在登革出血热患者体内存在高水平的登革特异性IgG1、IgG4和低水平的IgG2;当与抗原结合后,不同IgG亚型以不同的形式激活经典补体途径。激活的补体可增加血管渗透性.导致凝血功能的异常[11。由于FCR只存在于免疫系统相关细胞表面,而CR则更广泛存在于不同的细胞系,因此CR途径有利于解释广泛条件下存在的ADE现象。1.3prm抗体主要通过非fcr作用当形成病毒-抗体复合物后,抗体同细胞表面相关分子相互作用,引发病毒包膜蛋白的构象改变,增强病毒和靶细胞的膜融合作用引发ADE。该过程不受细胞表面受体特异性的影响。一般认为,中和抗体有助于病毒通过FcR感染细胞。PrM的抗体能同时特异性地识别病毒prM和细胞自身抗原,有效提高登革病毒结合FcR+细胞的能力,激发感染增强。prM抗体也能增强登革病毒对FcR-细胞的感染能力,在感染增强患者的血清中分离得到PrM抗体,证明了增强抗体通过非FcR作用也能诱发登革病毒的ADE现象[12。β2-微球蛋白、CD15和CD33等非FcR结合分子对登革病毒也有感染增强作用。ADE的强度与DC-SIGN的表达呈负性相关。成熟的树突状细胞在表达FcγRⅡa的同时低表达DC-SIGN,呈现明显的ADE现象,而未成熟的树突状细胞的DC-SIGN表达量是成熟树突状细胞的2倍,却不显示ADE。将未成熟的树突状细胞降低DC-SIGN和提高FcγRⅡa的表达后可检测到ADE存在,提示了登革病毒入侵树突状细胞途径的多样性(DC-SIGN或FcγRⅡa途径)。在适当浓度的DC-SIGN环境下,病毒优先通过DC-SIGN作用增强感染,而在高浓度的DC-SIGN环境下FcR不发挥ADE介导作用,类似现象在其他黄病毒中也有报道。同时,不同的入侵途径还影响到细胞感染强度、病毒产量以及细胞因子等因素。2影响因素：突变病毒ade2.1fcr+细胞ADE作用的靶细胞多为成熟的单核/巨噬细胞系,其他如抗原呈递细胞、B细胞、T细胞、上皮细胞、肝细胞、神经细胞、中性粒细胞和其他粒细胞等FcR+细胞在一定条件下也能成为ADE的靶细胞[13。同时,病毒感染中的ADE强度还与靶细胞种类、分化成熟及活化程度有关。2.2ade通过抗体检测ADE过程中的增强性抗体主要由二次感染异型登革病毒的患者产生或由婴儿从母体获得,可以是中和抗体、非中和抗体和交叉反应抗体。4个血清型的登革病毒在抗原上是密切相关的,初次感染登革病毒的患者血清中能产生大量中和抗体,这些抗体对同型病毒的中和作用可以持续数年,而针对异型病毒的中和作用只能持续3～4个月[14。当再次感染异型病毒时,这些低浓度的亚中和抗体与非中和抗体不再发生中和,而是通过ADE复合物的产生与受体结合,成为增强型抗体诱发感染增强。在病毒感染过程中,ADE现象的发生还与病毒感染和被动免疫的间隔时间有关。在病毒感染宿主的同时接种特异性抗体,该抗体可起到有效的保护作用,而在病毒感染后再接种抗体,该抗体则可能增强病毒感染。2.3e蛋白和prm蛋白登革病毒基因组编3个结构蛋白和7个非结构蛋白,结构蛋白包括衣壳蛋白(C),以二聚体或三聚体的结构存在的包膜糖蛋白(E),以及以1∶1的形式同E蛋白Ⅱ域结合的内膜蛋白(prM)。prM存在一个弗林蛋白酶(furin)切割位点,在高尔基体内被切割为信号肽(pr)和成熟的跨膜蛋白(M)。目前ADE的相关研究集中于E蛋白和prM蛋白。E蛋白Ⅱ域的鼠源单克隆抗体能增强登革2型病毒对K562细胞的感染,Zheng等[15将E蛋白H244位的组氨酸替换为丙氨酸,弱化了信号肽与E蛋白的结合,发现ADE现象消失。进一步的实验表明,H244位的改变不影响病毒结构蛋白的合成但能抑制病毒的包装和释放。在对不同浓度登革病毒的E蛋白单抗和prM单抗对比中发现,E蛋白单抗具有明显的中和作用,而prM单抗显示较强的ADE作用,中和作用不明显[16。Zybert等[17将完全不成熟的病毒经prM53～67区段的单抗和prM单抗2h2分别处理,发现病毒感染性显著增强。同时,构建弗林酶切位点90位赖氨酸缺失的登革病毒,发现ADE消失,这表明E蛋白、prM蛋白以及病毒的成熟在ADE过程中均发挥重要作用。2.4成分血热及登革型的表达病毒同靶细胞的结合不一定诱发ADE。在病毒-抗体复合物内化的过程中,还涉及病毒和靶细胞的其他细胞过程,改变了靶细胞正常的免疫功能。Chen等对比登革出血热和登革热休克综合征患者的临床数据后发现,在无异型血清存在时,登革Ⅱ型病毒感染机体后能产生大量的γ干扰素,而有异型血清存在时,γ干扰素、Th1表达下调,白介素-4、前列腺素E2、白介素-10表达上调。在登革热患者血清中,成熟树突状细胞产生的ADE能增强炎症因子的释放,仅在感染增强水平上可以检测到肿瘤坏死因子α、白介素-6、γ干扰素,提示这些分子可以作为ADE发生的信号物质。3ade对绿毒试验的发展3.1登革病毒ade研究登革病毒ADE受多种因素影响,包括病毒株、感染量、宿主细胞表面受体和抗体结合活性、抗体浓度、抗体亚型以及细胞因子等诸多方面,探讨核心因素并加以改造消除,是当前ADE的研究重点。登革病毒ADE研究的最大的挑战在于缺少合适的动物模型。人、低等灵长类动物及蚊是登革病毒的自然宿主,但只有人被登革病毒感染后出现临床症状。WHO推荐用灵长类动物来评价减毒黄热病疫苗的向神经性和趋内脏性,但是灵长类动物感染后仅能出现短暂性的病毒血症,所以只能通过检测病毒血症来间接评估。尽管乳小鼠经脑内接种可产生脑炎症状,严重时致死亡,但乳小鼠感染后的发病过程与人有所不同。而在体外实验中有中和作用的低剂量抗体被动免疫小鼠时却有ADE现象产生,提示体内外实验的差异性。目前常用干扰素受体缺陷的AG129小鼠作为动物模型。3.2结构蛋白基因和prm的不良反应登革病毒的ADE现象为相关疫苗的研发带来了新的挑战和提示。登革病毒包括4个血清型,且二次感染时亚中和水平的抗体可导致患者病情加重,因此,理想的登革疫苗应能诱导人体产生针对4型登革病毒稳定的终生