高效液相法测定一次性使用输液器中邻苯二甲酸二2-乙基己基酯溶出量

高效液相法测定一次性使用输液器中邻苯二甲酸二2-乙基己基酯溶出量

1.dehp与pvc输注的安全性评价二聚苯二羧酸二醇（deph）是第一种一次性使用塑料薄膜剂（pvc）的提议，被广泛使用。DEHP与PVC分子之间仅以范德华力和氢键相连,在临床使用过程中,DEHP会从PVC输液器中迁移出来,伴随药物输注进入人体。近年相关研究表明,DEHP具有慢性毒性[10~11],人体内的长期累积会影响肌肉骨骼系统和中枢神经系统、肝脏组织,特别是男性生殖健康。因此,美国FDA在其发表的关于DEHP增塑PVC医疗器械安全性评价的研究报告中,提出要重视和监控医疗器具中DEHP的释放。鉴于此,本文建立了测定一次性PVC输液器中DEHP溶出量的高效液相色谱法(HPLC)。2.材料和方法2.1超纯水系统、旋转蒸发仪、高压液相色谱图95%乙醇(成都科隆化学试剂公司,AR),甲醇(国药化学试剂公司,色谱纯),DEHP标准品(山东宏信化工股份有限公司,纯度≥99.5%),纯水/超纯水系统(美国Pall,Cascada),旋转蒸发仪(德国IKA,RV10),紫外/可见光分光光度计(美国Beckman,DU800),高压液相色谱(美国Waters,e2695-2489),国产一次性使用输液器(批号:2011051109)。2.2乙醇-超纯水浸提液配制按照GB14232.1-2004中醇溶出物测定要求,用95%乙醇和超纯水,通过液体比重天平测定并配制2000mL密度为(0.9373~0.9378)g/ml的乙醇水混合液作为浸提液。2.3色谱柱和流动相检测器:紫外/可见光检测器,检测波长n=272nm;色谱柱:SunfireC18,5.0μm,4.6mm×150mm;柱温:室温;流动相:甲醇(色谱纯);流量:1.0ml/min;进样量:5μl。2.4方法学研究2.4.1标准溶液的配制精密称取DEHP标准品2.0010g,用甲醇稀释至100ml,得到浓度为20.01mg/ml的标准储备液。取标准储备液,用甲醇稀释200倍,得到0.10mg/mL的标准工作溶液,用紫外/可见分光光度计在190nm~1100nm范围内进行扫描,根据吸收光谱曲线确定HPLC检测波长(n)。2.4.2dehs保留时间的确定取DEHP标准储备液,用甲醇稀释得到一定浓度的标准工作溶液,在2.3色谱条件下进样测量,得到DEHP的出峰保留时间。2.4.3标准曲线及进样测定取DEHP标准储备液用甲醇逐级稀释,得到2001ug/ml~5ug/ml浓度的标准溶液,按照2.3中色谱条件进样测定,得到各浓度的峰面积值。以峰面积值(Y)为纵坐标,DEHP浓度(X)为横坐标,绘制DEHP标准曲线并得到线性回归方程。2.4.4定量检测限的确定取DEHP标准储备液用甲醇逐级稀释,得到一系列浓度的标准工作溶液,按照2.3色谱条件进样测定,将信噪比≥100的最小DEHP浓度定为定量检测限。2.4.5标准工作溶液的测量取DEHP标准储备液用甲醇逐级稀释,得到浓度为1500µg/ml~5µg/ml的标准工作溶液,按照2.3色谱条件进样测定,每种浓度样品连续进样测定5次,得到其峰面积,计算变异系数(RSD),进行测量值的精确度表征,考察结果重复性。2.4.6加标回收率和变异系数试验准确吸取3份浸提液各1ml,与浓度分别为2000ug/ml、1000ug/ml、500ug/ml各1mlDEHP标准工作液均匀混合,得到高、中、低三种浓度的加标回收样品溶液,用旋转蒸发仪蒸干,冷却至室温,残余物用4mL甲醇涡旋溶解后得到样品检验液,静置数分钟后吸取上清,按2.3色谱条件对每个加标回收样品检验液测定3次,计算回收率(%)和变异系数(RSD)。2.5供试液及输注液制备将配制好的乙醇水浸提液用胶塞玻璃瓶分装(500ml/瓶,共4瓶,),悬挂于输液架上,取出输液器样品,模拟临床操作和条件,调节流速在2.5~3.0ml/min范围内(流速上限),收集全部流出液作为供试液1;重复上述操作,调节流速在0.5~1.0ml/min范围内(流速下限),依次对每瓶浸提液进行输注,收集全部流出液作为供试液2。将上述供试液分别用旋转蒸发仪蒸干,冷却至室温,残余物用4mL甲醇涡旋溶解后得到样品检验液,静置数分钟后吸取上清,按2.3色谱条件进样测定得到峰面积值,将其代入相应线性回归方程即得DEHP浓度(C,ug/ml),按下式换算每套输液器的DEHP溶出量(M,mg/套):3.结果与讨论3.1苯环吸收光谱剖面如图1所示,DEHP在190nm处有饱和键(C-C)吸收峰、202~238nm处有不饱和键(C=C、C=O)和杂原子饱和键(C-O-C)的吸收峰,在272nm处有苯环特征吸收峰。因此,以272nm作为HPLC的检测波长。3.2deph峰维护时间见图2。3.3dehp与其他药物的接触已有不少研究[2~3,5~8]对供试液的制备采用的是截取产品某一部分,对其进行浸泡和萃取的方式。这种方法在产品的质量控制评价方面是可行的[5~8],但通过这种方法测得的DEHP溶出量却难以反映产品临床实际使用时的风险[2~3],因为产品使用时与浸提液的接触是动态过程,而浸泡方法是静态过程,这两种浸提过程对DEHP的浸提能力会有较大区别。另外,产品使用时与浸提液的接触是整个内腔而不是局部,所以局部浸提的结果不能反映产品使用的真实情况。因此本研究采用模拟临床使用条件的供试液制备方法。再者,输液药物分为晶体液类(生理盐水、葡萄糖等)和脂类药物。已有安全性评价结果显示,DEHP在与晶体液接触时溶出极少,其进入人体的含量对人体几乎没有危害。而DEHP与脂类药物接触时却容易溶出。所以我们只针对一次性使用输液器输注脂类药物时DEHP溶出量进行研究。乙醇水溶液是脂类溶剂,可替代脂类药物作为本研究的溶出检测液。同时针对一次性使用输液器的使用要求,流速一般为0.5ml/min~3ml/min,本研究分别选择了0.5~1.0ml/min和2.5~3.0ml/min两种流速,全面考察此产品的DEHP溶出量。3.4标准曲线和线性回归方程由图3可知,线性回归方程1:Y=828.32X+22000,相关系数r=0.9986,结果显示DEHP浓度在2001ug/ml~5ug/ml范围内与其峰面积值线性关系良好。由于2001ug/ml~5ug/ml的线性相关范围较宽,在确定一次性输液器中DEHP溶出量时会存在较大误差,因此把整个浓度范围划分为高、低2个浓度等级,即2001ug/ml~100ug/ml和250ug/ml~5ug/ml,分别在各自范围内得到标准曲线和线性回归方程,如下:图4、图5显示,线性回归方程2:Y=804.71X+53814,相关系数r=0.9982;线性回归方程3:Y=924.42X+5588.6,相关系数r=0.9991。结果显示DEHP浓度在2001ug/ml~100ug/ml和250ug/ml~5ug/ml范围内与其峰面积值线性关系良好。3.5方法精神由表2可知,本方法的DEHP定量检测限为0.5ug/ml。3.6方法的精度见表3,RSD均<5%,表明此方法在较宽的线性范围内具有良好的精密度。3.7回收率的确定加标回收率测定考察的是供试液制备和处理以及仪器测试过程中待测目标物的前处理情况,以此来衡量测试方法的可行性。回收率一般在90%~110%之间比较合适。结果见表4,本方法回收率均在98%~103%之间,RSD均<5%,说明采用的测量方法准确度高,精确度好。3.8局限性的溶出量见图6、图7,由样品检验液1和2的DEHP色谱图及其峰面积,对比DEHP标准曲线,认为较适用的是2001ug/ml~100ug/ml范围内的线性回归方程2,据此计算出样品检验液1和2中的DEHP浓度(n=3),见表5。以2.5~3.0ml/min的流速用此一次性使用输液器进行输注,在本试验条件下每套产品DEHP溶出量(mg)为:524.52×4/1000=2.10以0.5~1.0ml/min的流速用此一次性使用输液器进行输注,在本试验条件下每套产品DEHP溶出量(mg)为:813.89×4/1000=3.26DEHP的溶出量与浸提液的接触时间成正比。2.10mg的溶出量是在临床输注流速上限的情况下测得,浸提液与输液器的接触时间较短,可视为最小溶出量;而3.26g的溶出量是在临床输注流速下限的情况,浸提液与输液器的接触时间较长,属于极限浸提,可视为最大溶出量。所以,此一次性使用输液器在临床使用输注脂类药物时的DEHP溶出量应在2.10mg~3.26mg之间。这个数值范围可作为本类产品DEHP风险分析的参考数据。4.dehp浓度范围的确定在我国的医疗器械分类监管中,其相关的国家和行业标准中并没有针对临床实际使用条件下PVC医疗器械产品中的DEHP溶出指标的限量要求和统一方法。因此,为更好地保护患者的身体健康,应尽可能地在相关产品标准上体现这一点