一株抗参锈腐病菌的丹参菌株f05发酵培养基的研究

一株抗参锈腐病菌的丹参菌株f05发酵培养基的研究

西洋参锈腐病是对西洋参栽培过程中造成的严重疾病，主要是由破坏柱菌cylimatendetrocan引起的土壤传播病。一般年发病率在30%左右,严重地块高达70%以上。患病参根变色腐烂,几乎失去药用价值和商品价值。对西洋参病害的防治,国内外多采用化学防治,1年需施药10余次。大量化学农药的施用,不但污染环境,而且带来农药残留问题,降低了品质以及经济效益。本实验筛选了病原菌的拮抗放线菌并对其进行了培养基的优化,同时探讨了生产上常用的农药与放线菌复配的可行性,以期实现对西洋参锈腐病进行综合防治。1材料和方法1.1糖培养基的制备分离与筛选培养基:高氏1号培养基;发酵种子培养基:液体马铃薯蔗糖培养基;原始发酵培养基:麦麸3%,豆饼粉1.5%;发酵培养基:本实验筛选的碳源为麦麸、玉米粉、玉米秸秆粉,氮源为豆饼粉、脲、磷酸氢二铵,无机盐为硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、氯化钠。1.2材料的分离选好采集地点后,铲去表层土,四分法取样,装入无菌牛皮纸袋中,带回实验室尽快分离。放线菌的分离参照文献方法,其筛选参照文献采用稀释平板法对土样进行分离,并筛选出对西洋参锈腐病菌的抑制率最大的菌株。抑制率=对照菌落半径−处理菌落半径对照菌落半径−原菌饼半径=对照菌落半径-处理菌落半径对照菌落半径-原菌饼半径1.3菌种的活化将筛选出的菌株培养于试管中,4℃冰箱保存备用。用前于32℃培养箱活化48h,将活化好的菌种扩繁于90mm的培养皿中。接种时,将平板菌种接种于盛有200mL无菌培养基的500mL三角瓶中,每培养皿接种3瓶,于32℃,140r·min-1振荡培养48h。1.4培养基的培养取5mL发酵种子液,接入盛有45mL无菌发酵培养基的250mL三角瓶中,每个处理3次重复。置摇床中32℃,140r·min-1振荡培养120h。培养结束后,取样测定活菌生物量(CFU·mL-1)。1.5菌落计数培养混皿法,每个处理3个稀释梯度,每个稀释梯度5个平行,32℃培养48h,进行菌落计数。实验结果使用SAS软件进行数据差异显著性分析。1.6发酵培养基的单因素试验1.6.1不同碳源对菌株发酵的影响以原始发酵培养基中碳源的含碳量为标准,分别用玉米粉、玉米秆粉对原始培养基中的碳源进行替换,其余组分不变,测定不同碳源对优选菌株发酵生物量的影响。1.6.2氮源种类对发酵生物量的影响分别用脲0.16g、磷酸氢二铵0.36g、豆饼粉0.75g、磷酸氢二铵0.75g、尿素0.75g以及0.25g豆饼粉+0.052g脲+0.12g磷酸氢二铵的组合对原始培养基中的氮源进行替换,其余成分不变,测定不同氮源对优选菌株发酵生物量的影响。1.6.3无产阶级筛选在原始发酵培养基中加入无机盐,其余成分不变,测定不同无机盐对优选菌株发酵生物量的影响。1.7分组配比的确定在发酵培养基配方单因素试验的基础上,用均匀设计确定培养基各组分的配比,采用4因素7水平7组试验的方式,即U7(74)的设计方案,每组试验3个平行。按1.4进行发酵培养,用1.5方法测定活菌生物量,使用DPS软件进行回归分析。1.8制备农药悬浮液选取目前生产上常用的5种农药,代森锰锌、代森铵、乙膦铝、多抗霉素、阿米西达进行放线菌的农药耐受性试验。将农药按所需稀释倍数配成溶液,备用。取培养好的菌种用100mL无菌水洗下,制成孢子悬浮液,备用。向200mL马铃薯蔗糖培养基中加入10mL上述孢子悬浮液,铺成平板,待冷却凝固后,放入牛津杯,并加入上述5种农药的不同稀释倍数的药液,25℃培养3d,用游标卡尺测量抑菌圈直径。2结果与分析2.1生防菌f06-f9对妇人费氏原螯虾的防效用平板稀释法共分离到放线菌28株,将初选中有较好拮抗效果的5株放线菌进行复筛。结果见表1,拮抗菌F05对西洋参锈腐菌的抑制效果最好,菌落半径达到8.52mm,抑制率达到90.90%。其次F06菌落半径为9.86mm,F19,F22菌落半径为14.48,16.56mm,而生防菌F11的防效最差,菌落半径达到19.22mm。因此本实验选择菌株F05作为发酵对象。2.2抗逆反应型f052.2.1培养基蛋白的浓度以玉米秆粉为碳源的培养基活菌生物量最多,达到1.99×108CFU·mL-1。经0.01水平显著性分析,已达到极显著水平,其次为麦麸1.19×108CFU·mL-1,玉米粉仅为4.2×107CFU·mL-1。这可能是因为培养基中加入玉米粉后,培养液会变得很黏稠,导致溶氧量降低,从而降低了活菌生物量。因此选择玉米秆粉做碳源。2.2.2氮的来源以磷酸氢二铵为氮源的培养基活菌生物量最多,已达到3.03×108CFU·mL-1,经0.01水平显著性分析,已达到极显著水平。2.2.3细菌活菌生物量经0.01水平显著性分析可知,在5种无机盐中,碳酸钙抑制菌体生长,与对照相比差异显著;氯化钠和硫酸亚铁与对照相当,差异不显著;而硫酸镁和磷酸氢二钾促进了菌体的生长,活菌生物量分别达到1.87×108,4.07×108CFU·mL-1,差异极显著。因此,将硫酸镁、磷酸氢二钾作为该培养基的无机盐成分。2.3培养基配方优化本试验选用U7(74)均匀设计表,考察玉米秆粉、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、硫酸镁4种因子不同水平对F05菌体生长量的影响,见表2。用DPS软件对表2数据进行多元二次逐步回归分析,得出活菌生物量与各因素关系的方程Y=-188.3993+150.8510X1-21.0265X12+129.3979X1X3-2458.9638X2X3+55742.1070X3X4,决定系数R2=0.9991,F=245.5638,P<0.05,该回归方程具有统计学意义。优化后的培养基配方为:X1为玉米秆粉3.7206%,X2为磷酸氢二铵0.3003%,X3为硫酸镁0.0400%,X4为磷酸氢二钾0.0400%,理论活菌生物量为1.6070×109CFU·mL-1。用相同的试验方法,采用最优培养基组分做重复试验,得到活菌生物量15.7×108CFU·mL-1。因此,上述试验数据是合理的,采用均匀设计的方法是可行的,能减少试验次数,而且得到最优的试验参数。2.4抑菌圈的测定5种农药中代森铵、代森锰锌对放线菌的生长均有较强抑制作用,乙膦铝抑制作用较弱,而多抗霉素、阿米西达未产生抑菌圈,即这2种农药对放线菌无抑制作用。因此,在生产中可将这2种农药与放线菌复配使用,见表3。3秸秆生物利用技术本试验在培养基组分筛选时没有考虑精细原料,而是以粗放原料为筛选对象,并得到以玉米秸秆为碳源,磷酸氢二铵为氮源的发酵培养基,为实现工业化发酵奠定基础。据报道,我国每年可生产秸秆7亿吨。近年来,秸秆已经由传统的燃料、饲料、肥料变为一种无用的负担物,进而又造成秸秆就地焚烧日趋严重,烟雾弥漫,既污染环境又严重影响了交通安全。因此,合理利用秸秆十分必要。本实验以玉米秸秆作为碳源,发酵放线菌,在实现对西洋参进行生物防治的同时,也为秸秆的高价值转化提供了新的思路。关于氮源的筛选,本实验从豆饼粉、脲、磷酸氢二