液相色谱串联质谱法测定青花菜中l-硒甲基硒代半胱氨酸的含量

液相色谱串联质谱法测定青花菜中l-硒甲基硒代半胱氨酸的含量

1富硒青花菜中含硒化合物的检测辽宁能有效地扮演其他养分的生物学功能。研究发现,人体和动物体内硒的吸收、作用效果和毒性等与摄入硒的化学形态密切相关。L-硒甲基硒代半胱氨酸(SeMC)是比硒蛋氨酸(SeMet)和亚硒酸钠具有更高生物活性的一种小分子有机含硒化合物,可通过诱导细胞凋亡等机制发挥抑癌作用。近年来,多种现代分析技术被尝试用于富硒生物样品中含硒化合物的鉴定和定量分析,最值得推荐的是液相色谱质谱联用技术,具有灵敏度高,专属性好,分析速度快等特点。Finley等已运用ICP-MS技术证实富硒青花菜含有SeMC。本研究拟建立测定富硒青花菜中SeMC的液相色谱串联质谱法(LC-MS-MS),并通过方法学考察,以获得高效、准确、特异性和实用强性的定量检测富硒青花菜中SeMC的分析技术。2实验部分2.1美国法上的纺粘设备1100高效液相色谱系统(美国安捷伦公司);API4000三级四极串联质谱仪(美国应用生物系统公司);MettlerAE163万分之一分析天平(美国MettlerToledo);VORTEX-TGENIE涡流混匀器(scientificindustry);Barnstead纯水机;acrodisc25mmsyringe0.2μm过滤器(美国Pall公司);电子恒温浴锅。甲醇为色谱纯(美国Fisher公司);99%七氟丁酸(Lancaster公司)。CH3-Se-CH2-CH(NH2)-COOHSeMC(美国PharmacySe公司)。实验用水由Barnstead纯水系统制备。2.2合成青花菜总硒含量的测定市购普通青花菜,富硒青花菜采自我国高硒地区,经洗净、阴干、切碎、60℃烘干后,研磨,过0.16mm筛,采用2,3-二氨基萘荧光分光光度法测定这两种青花菜总硒含量分别为13和320mg/kg。准确称取0.1g样品于50mL具塞离心管中,加入5mL18.2MΩcm的纯水,沸水浴加热提取1h,期间,每隔20min涡流混匀一次。提取液室温放置自然冷却,用0.2μm滤器过滤。2.3氟丁酸溶液10.1%7%v.7WatersSymmetryC18色谱柱(150mm×3.9mmi.d.,5μm),柱温20℃。流动相:甲醇-0.1%七氟丁酸水溶液(30∶70,V/V)。流速:500μL/min;进样量为10μL。ESI离子源,正离子电离方式,电离电压5500V;雾化气:高纯氮气;碰撞活化(CAD)参数为6;气帘气(CUR)20psig;雾化气(GS1)35psig,辅助气(GS2)40psig;离子源温度(TEM):450℃;扫描方式:多反应离子监测(MRM)。3结果与讨论3.1流动相的影响比较水、甲醇、丙酮和二氯甲烷等溶剂对青花菜中SeMC的提取效率。由于纯水提取效率较高,实验选择纯水作为提取溶剂。实验发现,沸水浴加热提取优于常温超声方法。考察不同比例的甲醇水溶液(70%、50%、30%和20%)作流动相的情况,比较发现,在30%甲醇条件下,SeMC在样品中与杂蜂分离较好,但峰形存在拖尾现象。流动相中添加了少量七氟丁酸,峰形有较好改善。综合考虑分离效果、分离时间,选择甲醇-0.1%七氟丁酸水溶液(30∶70,V/V)为流动相。3.2质谱分析结果首先经Q1全扫描选择母离子,然后进行二级质谱扫描,得到化合物的二级质谱图(图1)。根据质谱图分析结果,选定进行MRM扫描的离子通道SeMCm/z184.0→(167.0;94.9)。在选定的仪器条件下,标准溶液液相色谱图见图2a。从图2a可以看出,SeMC的保留时间为3.86min,色谱行为良好。3.3青花菜基质对富硒离子检测的影响普通青花菜在保留时间位置并没有检测到SeMCm/z184.0→(167.0;94.9)的离子对色谱峰,表明普通青花菜基质不会干扰采用LC-MS-MS技术检测富硒样品中SeMC的含量(见图2b)。富硒青花菜样品中SeMC保留时间和标准品一致,加标后,保留时间不变,信号增高,见图2c和2d。3.4标准曲线和检出限在普通青花菜中添加不同量的标准溶液,按照2.3和2.4所述样品前处理方法及仪器条件进行测定,以样品的浓度(x,μg/L)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标(外标法),根据离子对响应强度,选择SeMCm/z184.0/94.9作为定量分析的离子对,获得标准曲线回归方程(n=6)为:SeMC(184.0/94.9):y=1940x+395(r=0.9993)。结果表明,SeMC在0～200μg/L的浓度范围内线性关系良好。采用信噪比S/N=3来计算,得到本方法的最低检出限为SeMC0.1mg/kg。采用信噪比S/N=10来计算,得到本方法的最低定量浓度为SeMC0.5mg/kg。3.5富硒青花菜样品的质谱行为取普通青花菜样品0.1g,按照前面所述方法配制3个浓度的样品,每一浓度进行6样本分析,连续测定6d,并与标准曲线同时进行。求算回收率和精密度,结果见表1。我国高硒地区采集的青菜花,经处理后用液相色谱-串联质谱联用仪进行分析测定,计算SeMC的含量为7.91mg/kg。研究结果表明:LC-MS-MS通过阳离子对的选择,能有效排除含有大量杂质的植物提取液基质的干扰,在有效分离含硒化合物的同时,能在线完成富硒青花菜样品中SeMC中的选择性检测。此外,Finley等发现SeMC为青花菜的主要含硒化合物