分子生物学学习资料：answer-ch8

8.3.给出一个模型来解释T7噬菌体如何控制其转录。答：T7噬菌体，不同于枯草杆菌中的SPO1产生新的σ因子来改变寄主RNA聚合酶从早期到后期的特异性，而是编码新的RNA聚合酶特异性地继续表达噬菌体基因。1)前期转录（classI）利用的是寄主RNA聚合酶全酶，前期噬菌体蛋白质产物中包含有T7RNA聚合酶。2)后期转录（classIIandIII）利用前期转录的产物T7RNA聚合酶继续后面的基因转录过程。8.4.描述一个实验说明在枯草杆菌中，σE因子特异性识别孢子生长的0.4-kb启动子，而σA识别的是一个营养生长的启动子。答：用分别含σA或σE的RNA聚合酶对质粒p213进行转录。将EcoR1-Hinc11质粒片断进行DNA印迹，再用以上标记的转录产物分别对其杂交（记为lane1,lane2）。通过放射自显影可看到：lane1上只有一条带，根据电泳位置可判断转录产物与3050-bp的片断进行了杂交；而lane2上有两条带，表明转录产物与3050-bp和770-bp的片断杂交了。由于营养生长的启动子序列和孢子形成的启动子序列分别位于3050-bp和770-bp的片断上，可知σA只转录了营养生长的基因，而σE对营养生长的基因和孢子形成的基因都进行了转录。8.5.概括枯草杆菌细胞在形成孢子过程中改变转录体系的机制。答：当枯草杆菌孢子形成时，一套特异性的孢子形成基因被激活，而很多，但不是全部，营养生长的基因停止被转录。一些新的σ因子取代了营养生长的σ因子，来指导孢子形成基因的转录。每个σ因子都有其特别的启动子识别序列。8.6.如何得知在枯草杆菌的孢子形成过程中，σK是由两个基因经过重组形成一个基因的转录产物？答：σK是由spoIVCB和spoIIIC两基因经过重组形成sigK基因的转录产物。通过对这3个基因进行测序，便可得出上述结论。spoIVCB----GCGQGGTGTATTGAAAATGAGATTGT-----spoIIIC-----------------------ATGAATAATGAAATCCTCATGCAT---sigK ----GCGQGGTGTATTGAAAATGAAATCCTCATGCAT---8.7描述一个实验说明在枯草杆菌中，σE因子识别spoIID启动子序列，而其它σ因子无法识别该序列。答：在coreRNApolymerase中分别加入σE或σB与σC，然后对含spoIID启动子序列的限制性片断进行失控转录。对转录产物进行电泳，可看出只有含σE的RNA聚合酶转录出长度约700个核苷酸的产物，即由spoIID启动子得到的失控转录产物。说明只有σE识别spoIID启动子序列。8.9为什么说AnabaenaGlu合成酶基因含有两个不同的启动子在调控上具有优势？答：Anabaena7120是一种细胞排列成长链状的藻青菌，或蓝绿藻。在NH4+有效时，这些细胞可以全部生长；但是当NH4+供应不足，一些有生长力的细胞分化为可以为其他细胞固定氮的异性细胞。在固氮条件下，大多数异性细胞中的活性基因被切断，同时固氮基因启动。这种转变的主要机理是一个σ-因子中的转换。识别基因的大肠杆菌状启动子的σ被一个对nif启动子具特异性的固氮s取代。然而一些活性基因在固氮的过程中也必须保持其活性。在这些谷氨酰胺合成酶基因中，通过向谷氨酸盐添加NH4+，谷氨酰胺合成酶制造出有生长力以及固氮细胞中都需要的aminoacidglutamine。在两种情况下，glnA基因在下述机理下保持活性，即glnA基因有两个启动子，每一个作用于一个σ-因子，转录起始位点与这两个启动子结合，活性起始位点位于nif-like起始位点上游62bp处。8.10为什么说大肠杆菌Glu合成酶基因含有两个不同的启动子在调控上具有优势？答：大肠杆菌的glnA基因的调节在某种意义上说也是依赖固定氮的有效性。当碳是限制因素时，小型蛋白可以合成，故对谷氨酰胺的需求较小。在这种情况下，基因从一个较弱的启动子glnAP1开始，靠主要全酶Eσ70转录。从另一方面来讲，当固定氮是限制因素时，大量需要谷氨酰胺合成酶，在谷氨酰胺中尽可能多地诱导有效的NH4+。谷氨酰胺于是为其他细胞中物质提供氨基。在这样的情况下，glnA从一个位于glnAP1下游115bp的强启动子glnAP2开始，通过Eσ54转录。这样，自弱启动子到强启动子的转换的支配就由σ54代替主要的σ70完成。8.11描述一个模型解释大肠杆菌在热激反应中快速响应。答：热激反应在不到一分钟内即可开始，而如此短时间不够一个新的s-因子合成。这样就有理由想到有一个先前存在的σH，它可以突然暴露，更有效地与σ70(σA)竞争到核心聚合酶。8.12λ噬菌体的裂解循环中的前早期-延迟早期-晚期转录转换是怎样进行的？答：λ噬菌体的裂解循环中的前早期-延迟早期-晚期转录转换受抗终止因子控制。两个前早期基因之一，即编码cⅠ基因抑制者的cro，保证溶菌性循环的继续。另一个基因产物，N，是一个允许RNA聚合酶忽视前早期基因终止子的作用而进入延迟早期转录阶段的一个抗终止因子。延迟早期基因中的Q编码另一个抗终止因子（Q）。它可以识别暂停转录的复合体并且绑定在qut位点。然后Q与聚合酶绑定并改变它，通过这种方法忽略终止子并恢复转录，继续进入晚期。8.13给出一个模型说明N蛋白引起的抗终止作用在裂解生长的晚期过程中的作用，涉及到哪些蛋白？答：Fig.8.13在N-directedantitermination的模型及其所涉及的蛋白如图所示,五种蛋白(N,NusA,NusB,NusG,andS10)参与了立即早期转录(immediateearlytranscription)的抗终止作用。NusA和S10结合在RNApolymerase上,N和NusB分别结合在转录产物nut位点的区域boxB和boxA上。N和NusB分别结合在NusA和S10上，它们使转录产物附着在聚合酶上。聚合酶上的这些改变使之可以通读过立即早期基因末端的终止子。Q对晚期基因的表达是必须的，Q结合在qut位点的Q-binding区域上，此区域处于latepromoter的下游。它同样可以使聚合酶通读过终止子，从而转录晚期基因。8.14ThePREpromoterisbarelyrecognizableandisnotinitselfattractivetoRNApolymerase.HowcanthecIgenebetranscribedfromthispromoter?答：PRE位于PR和cro的右侧。它调控向左的转录：先通过cro之后通过cI。因此PRE使cI先于任何阻抑物表达。cro的自然转录方向是从PR起向右转录，所以这样向左的转录使从PRE起的转录产物是cro的“anti-sense”转录产物，而是cI的“sense”转录产物。RNA的cI部分翻译之后将会生成阻抑物，但是anti-sensecro将不会被翻译。AntisenseRNA能对噬菌体的原溶性做出贡献，因为croantisense的转录产物可以结合到cromRNA上，从而干扰mRNA的翻译。8.15描述实验说明CII蛋白可以结合到λDNA的哪一区域？并给出实验结果。答：Fig.8.15CⅡ结合在λDNA的-35box区域上Ptashne和colleagues通过DNasefootprintanalysis来研究CII与两个早期λ启动子（PRE(a)andPI(b)）的关系。图(a)中，泳道1–4包含了如下用量的CII：泳道1，无；泳道2，10pmol；泳道3,18pmol；泳道lane4,90pmol。图(b),泳道1–4包含了如下用量的CII：泳道1，无；泳道2，18pmol；泳道3,45pmol；泳道lane4,100pmol。左右两个CIIfootprint的实验结果显示这两个启动子都包含了–35box，说明CⅡ结合在λDNA的-35box区域上。8.16图示并解释DNaseFootprinting技术，这一技术可以获得什么信息？答：Fig.8.16(a)DNasefootprinting技术示意图Fig.8.16(b)DNasefootprinting实验结果图(b)中,泳道1–4包含了如下用量的蛋白：泳道1，无；泳道2，10pmol；泳道3,18pmol；泳道lane4,90pmol。DNasefootprinting（足迹法）是用来鉴定DNA或RNA的蛋白结合部位的一种技术。用核酸酶来消化放射标记的有或没有特定结合蛋白的核酸样本,由于DNA或RNA带结合蛋白的部位受到保护不被消化,因而受保护部分在凝胶电泳上看不到其片段,从而来鉴定蛋白的结合部位。8.17CII蛋白和RNA聚合酶如何同时作用于DNA的同一区域？答：Ptashne和coworkers的DMSprotectionexperimentswithCⅡ显示和CⅡ接触的碱基与和RNApolymerase接触的碱基分别位于螺旋结构的两侧。这就是说，这两种蛋白分别结合在DNA双螺旋结构的两侧，它们与DNA的结合是协同的而不是相互竞争的。8.18设计实验说明λrepressor如何正向和负向调控其自身的合成？这个实验显示了λrepressor对cro基因转录的有什么作用？答：λrepressor的结合位点为Or和OL，如下图所示。两个结合位点都可以细分为三个结合位点，OR1,OR2,OR3，其中repressor与OR1的结合最紧密，与OR2的结合能力次之，与OR3的结合能力最弱。OR位于启动子PR和PRM之间，它可以控制向左转录，得到cI基因产物；也可以控制向右的转录，得到cro基因的产物；OR3位点就处在PRM之中。当repressor存在时，repressor首先结合到OR1上，这个结合帮助其与OR2的结合，当repressor与这两个位点结合时，可以与结合在PRM上的聚合酶接触，并促进聚合酶从这个启动子开始向左转录，从而转录出更多的repressor，即正向调节其合成。当转录生成的repressor过多时，大量的repressor也可以结合到OR3上，这时，聚合酶就不能与PRM结合，向右的转录被抑制，即负向调节其合成。同时，当repressor结合到OR位点时，repressor起抑制PR启动子活性的作用，所以向右的转录不能进行，即减少了cro基因的转录。图8.18(A)λrepressor与OR的结合维持了溶原周期。Repressor结合到OR1和OR2位点时，可以促进聚合酶与PRM的结合，并向左转录cI基因利用类似run-offtranscription的实验方法可以验证这个模型。以含有OR，PRM，PR，cro，cI各个位点的序列为模板，如下图所示。实验中加入不足的UTP，因此转录进行一段时间后会停止，得到未转录完全的片段。图8.18(B)用于run-offtranscription的模板链，箭头表示转录停止的位置。实验时，加入不同浓度的repressor，检测产物的长度，如果向左转录cI基因，那么产物片段的长度为300nt，而如果向右转录cro基因，那么产物长度为110nt。实验结果显示，当repressor浓度比较小的时候，产物中110nt片段的量就比较小，且随着repressor浓度的升高，其量更加减小；而当repressor浓度比较小的时候，可以看到有明显的300nt长度的产物生成，说明repressor浓度比较低时，可以促进相左对cI的转录；而当repressor的浓度比较高的时候，可以看到，300nt长度的产物也消失，说明当repressor浓度高时，对其自身的合成有负调控的作用。图8.18(C)研究repressor对cI和cro转录的影响8.19说明利用基因相互抑制来研究蛋白间相互作用的原理。答：蛋白之间的相互作用主要是通过几个关键的氨基酸来完成的，其中一个蛋白的基因发生突变，从而使一个氨基酸改变后，两个蛋白即不能发生相互作用；然而通过改变另一个蛋白的基因，使第二个蛋白质的一个氨基酸也发生改变，那么改变后，两个蛋白质可能再次发生作用。这就是基因间抑制的原理，一个基因的突变抑制了另一个基因突变所产生的影响。可以利用下图来说明：图8.19基因间抑制的原理。原repressor可以与聚合酶相互作用，当repressor发生突变时，聚合酶不能与之相互作用，而当聚合酶也发生相应的突变时，两者之间恢复相互作用8.20设计一个基因间抑制的实验，说明λrepressor与E.coli的σ因子之间的相互作用，并给出实验结果。答：根据上题所述的实验原理，可以利用这个实验：在E.coli的染色体上插入两个溶原噬菌体体的DNA片段，一个是含有cI位置pc突变的λ原噬菌体（λprophage），且cI基因位于弱启动子Plac的控制下，所以，这个原DNA可以表达突变型的repressor；另一个溶原噬菌体为P22噬菌体，这个噬菌体含有一个抗kanamycin基因，并且这个基因处在PRM,OR的控制下。再向细胞中转入含有rpoD基因的质粒，这个基因可以转录一个与repressor相作用的σ因子。然后在含有kanamycin的培养基上培养转染的细胞。当rpoD基因没有突变或有一个不相关的突变时，rpoD基因的σ因子产物与核心酶结合但不能与repressor结合，所以不能转录抗kanamycin基因，细胞将会死亡；而当rpoD基因有合适的突变，即可以与突变型的repressor互补的突变时，σ因子与核心酶结合，并与repressor结合，则可以转录抗kanamycin基因，所以细胞可以生存，这样，不但可以验证λrepressor和σ因子的作用，还可以得知哪种突变是与repressor突变互补的。图8.20利用基因间抑制验证λrepressor和σ因子的作用8.21建立一个模型说明λ噬菌体侵染E.coli细胞后，cI和cro基因对于建立溶原周期和裂解周期的竞争。答：噬菌体侵染细胞后，在没有repressor的条件下，转录早早期基因，可以得到N蛋白和cro基因的产物，其中N蛋白是一个反终止蛋白，其作用是继续转录延迟早期基因；cro基因的产物Cro蛋白可以结合到OR3上，这样就占据了PRM位点，所以聚合酶不能在此处向左进行转录，只能结合PR，并防止所有早期基因，包括cII和cIII基因，没有了CII蛋白，就无法启动cI基因，所以不能合成repressor，即抑制了溶原周期。当没有N蛋白时，转录在早早期与延迟早期之间停止。就在cro基因的下游，含有cII基因——一个延迟早期基因，这个基因转录出CII蛋白，这个蛋白结合到cro基因右方的PRE启动子上，可以促进聚合酶在此处结合，并向左转录，进而得到cI基因的产物repressor；同时向左的转录得到cro基因的反义RNA，这个反义RNA不能翻译出Cro蛋白。Repressor结合到OR1和OR2上，对聚合酶结合PRM启动子，向左转录