医学免疫学实验课件：基于抗原抗体反应的免疫学检测方法

2023/12/71基于抗原抗体反应的免疫学检测方法基本原理抗原（表位）和抗体（高变区）分子结构及立体构型的互补。

Lockandkeymodel2023/12/73氢键疏水作用

范德华引力

静电吸引作用抗原-抗体结合力特异性

非共价键可逆性

抗原抗体反应的基本类型

1.Precipitation---沉淀反应2.Agglutination---凝集反应3.Radioimmunoassay4.Enzyme-linkedImmunosorbentAssay5.Immunofluorescence6.WesternBlotting7.FlowCytometry8.ImmunoelectronMicroscopy沉淀反应（Precipitation）：

可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生结合，出现肉眼可见的沉淀物。

凝集反应（Agglutination）：颗粒性抗原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集物。免疫沉淀反应(precipitation)

原理：可溶性抗原+抗体白色沉淀实验内容：单向定量免疫电泳(火箭电泳)琼脂糖双向免疫扩散

单向定量免疫电泳(火箭电泳)

把抗原放在含有抗体的凝胶内电泳，其沉淀弧形似火箭。当定量的抗原在含有适量抗体的琼脂中泳动时，走在前面的抗原遇到琼脂中的抗体时，达到适当比例时形成大的不溶性复合物而发生沉淀，不再移动；未与抗体结合的抗原以及较小的可溶性复合物可穿过此沉淀继续向前迁移，形成新的沉淀，但沉淀带越来越窄，直至全部抗原与抗体结合形成火箭峰样沉淀。抗原含量越高，火箭峰越长。

实验流程抗体+琼脂琼脂板

打孔数个(孔与板缘距离1cm)

加入样品(由低浓度到高浓度)

电泳2023/12/7912345

Add50uldilutionbuffer（稀释液）toNo.1-5tubesseparatelyAdd50ulstandardsolution（标准品,Ag）toNo.1，上下吹打混匀；Transfer50ulliquidfromNo.1toNo.2tube,sotheconcentrationofsolutioninNo.2ishalfofNo.1(1:4)；Suck50ulliquidfromNo.2andthenpipettetoNo.3tube,sotheconcentrationofNo.3solutionishalfofNO.2(1:8)……No.C1:21:41:81:161:32SerialDilution1.倍比稀释（SerialDilution）

1:21:41:81:161:3250ul稀释液50ul血清50ul50ul2.打孔templateagaroseslide将胶版置于模板上，用打孔器在琼脂板的一端垂直，间隔均匀地打一排小孔，用针头小心，完整地挑出孔中琼脂3.加样每孔小心加入10l

样品1－5孔加入1:32,1:16,1:8,1:4,1:2的标准品

剩下一孔加入待测样品。1:32,1:16,1:8,1:4,1:2,sample4.电泳将琼脂板放入电泳槽电泳:80v,

2－3h.13+-2023/12/714实验步骤1.取熔化并冷却至50°c的1%琼脂糖凝胶，加入anti-IgG抗体，混匀后浇至玻璃板上；2.凝固后，如下图打孔；3.第1-5孔加入10

l经倍比稀释的标准血清样品：

1:32，1:16，1:8，1:4，1:2。第6孔加入待测血清；4.将琼脂板放入电泳槽，用滤纸与电泳槽搭桥连接，样品孔一端接负极。电泳80v，2-3h。（-）（+）实验步骤（续）取出琼脂板，在0.5%考马斯亮蓝中染色，6%醋酸脱色。6.从加样孔的圆心到峰尖量取各孔样品沉淀峰的高度。以抗原浓度为横坐标,峰高为纵坐标绘制标准曲线。根据标准曲线，计算待测样品中抗原的含量。琼脂糖双向免疫扩散实验原理：将Ag与Ab两种溶液置于琼脂糖凝胶的不同位置，使两者都在凝胶中自由扩散，抗原与抗体相遇并在比例合适处形成可见的乳白色沉淀线。沉淀线的数目、位置、形状等，与抗原或抗体的纯度、浓度、扩散速度等有关。实验流程

铺制琼脂糖凝胶板

打孔(梅花形)

加入样品(中心孔内加入抗IgG血清,其余加入待检血清，37c，24h）。DoubleImmunodifusion实验步骤

将已溶化的1%生理盐水琼脂糖3-4ml倾注在玻片上制成厚薄均匀的凝胶板。待凝固后，打梅花孔（如下图）。在中心孔内用加样器加入10

lanti-IgG血清（抗体）。在第1-5孔内分别加入10

l经系列倍比稀释：

1:32，1:16，1:8，1:4，1:2的待测血清样品（IgG），在第6孔内加入生理盐水对照。243165实验步骤（续）

4.将凝胶板放湿盒中，37

c，24h后观察结果，以出现明显沉淀线的最大稀释的抗体孔为终点孔，终点孔中抗体的稀释倍数（最高稀释度）即为该待测血清IgG的效价。243165凝集反应(agglutination)

原理：颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合→肉眼可见的凝集物；方法：直接凝集、间接凝集、间接凝集抑制试验直接凝集试验-血型鉴定

血型抗原：红细胞表面的同种异型抗原人类红细胞表面A、B抗原不同：A、B、AB、O血型同一人血清中不含与本人血型抗原相应的抗体

表型 血型抗原 检测抗体 A型 A 抗AB型 B 抗BAB型 AB －O型 H 抗A抗B

2023/12/724SameAginbothwells=>fused&continuouslineUnrelatedAgsinseparatewells=>bandscrosseachotherRelatedAgsinseparatewells=>partialidentityProspectiveResultofDoubleImmunodiffusion2023/12/725Sam