酶的分离纯化

Chapter4

TheExtraction,SeparationandPurificationofEnzyme酶的分离纯化Contentsofchapter4第一节、发酵醪液预处理第二节、酶的初步纯化第四节、酶的浓缩与干燥第五节、酶纯化方案的设计与评价第三节、酶的高度纯化第一节、发酵醪液预处理一、酶在细胞中分布及发酵醪液预处理二、细胞破碎三、发酵液的固液分离第一节、发酵醪液预处理

一、酶在细胞中的分布及发酵醪预处理1、酶在细胞中分布胞外酶：水解酶类，易收集，不必破碎细胞，缓冲液或水浸泡细胞或发酵液离心得到上清液即为含酶液。胞内酶：除水解酶类外的其它酶类，需破碎细胞，不同的酶分布部位不同，最好先将酶存在的细胞器分离后再破碎该细胞器，然后将酶用适当的缓冲溶液或水抽提。细胞结构与酶分布2、酶分离原则：在增加酶得率和纯度的同时，尽可能避免高温、过酸、过碱、剧烈的震荡及其它可能使酶丧失活力的一切操作过程。尽最大可能保存酶的活力。3、酶的提取、分离纯化技术路线预处理酶初步分离纯化酶浓缩、干燥酶产品发酵醪液沉淀分离、提取、离心酶高度分离纯化细胞破碎、离心、过滤膜过滤、层析分离，电泳分离预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞破碎（分离胞内产物）等。初步纯化（roughfractionation）（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质。高度纯化（finefractionation）（精制）：除去与产物性质相似的杂质。浓缩与干燥（concentrationanddesiccation）（成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。二、细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎JY92-IID超声波细胞粉碎机细胞破碎珠高压细胞破碎机DY89-I型电动玻璃匀浆机机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理本章目录三、发酵液的固液分离1.过滤：借助过滤介质使不同大小、不同形状组分分离。过滤介质：滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属等根据推动力产生条件不同过滤分为：

（1）常压过滤：以液位差为推动力。如滤纸、吊篮或吊袋过滤（2）加压过滤：以压力泵或压缩空气产生的压力为动力如板框压滤

（3）减压过滤：在通过过滤介质下方抽真空，使产生压力差。如转鼓式真空吸滤机。在发酵醪液预处理中采用的是粗滤，即过滤悬浮液中直径大于2μm的颗粒2、离心分离

离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。（一）离心机的选择离心机的种类1、常速离心机最大转速8000rpm(r/min),用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等分离；2、高速（冷冻）离心机

1×104-2.5×104rpm,用于沉淀、细胞器等分离；3、超速离心机转速2.5-8×104rpm，用于DNA、RNA蛋白质及细胞器病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。分制备用、分析用、制备及分析用三种。分析用超速离心机装有光学检测系统、自动记录系统、数据处理系统；实验室离心机温度类型：常温及冷冻超速离心机均为冷冻型。使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心头。使用超速离心机时先抽真空。离心的形式外摆式一般为低速，角式由低速到超速均有。角式离心机和离心头（转子）角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖要旋紧。离心机的大小：落地式及台式小台式离心机离心管材质：玻璃，塑料强度：和离心速度相配大小：和转子配套高速超速管要加盖离心机操作平衡、定温、定速、定时。（二）离心方法的选择所分离的颗粒大小和密度相差较大:常速、高速离心;若从样品液中分离2种以上大小和密度不同的颗粒：差速离心;超速离心:差速离心法和密度梯度离心法，后者又分速率区带离心和等密度离心。离心分离示意图（a）离心前的悬浮液（b）～（e）离心不同时间后颗粒的沉降情况

差速离心示意图已破碎的细胞沉淀（细胞核）上清液沉淀（细胞膜碎片、线粒体、溶酶体）上清液沉淀（核糖核蛋白体）上清液（可溶性组分）500g,10’10000g,10’1．差速离心（differentialcentrifugation）

采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。适用：分离大小和密度差异较大的颗粒。优点：操作简单。缺点：1）分离效果较差，不能一次得到纯颗粒。

2）壁效应严重。

3）沉降的颗粒受到挤压2．密度梯度离心

(区带离心)

（densitygradientcentrifugation）样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。常用的密度梯度溶液是蔗糖、甘油溶液。（5%～60%）密度梯度介质一般采用密度梯度混合器进行制备特点：区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度。适宜分离密度相近而大小不同的固相物质。密度升高3种梯度示意图BABAABa.线性梯度b.凸型梯度c.凹型梯度Densitygradientultracentrifugation3.等密度梯度离心又称沉降平衡离心（sedimentationequilibriumcentrifugation）根据颗粒的密度不同而进行分离。离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。常用氯化铯（CsCl）作为梯度介质。特点：

介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。本节目录梯度回收1、穿刺法采用针穿刺离心管底部，使梯度靠重力自由滴出，然后依次作分布收集，此法适用于薄壁塑料管，流出液部分收集于小试管中，经分析决定取舍或合并。此法对梯度扰动小，但离心管不能再用，不适合回收管底有沉淀的梯度，也不使用于不锈钢或厚壁塑料管。2、取代法浓取代液收集稀浓通入空气、轻液体收集浓稀优点：是不破坏离心管，能用于较粘梯度，可借光学（放射性）系统进行流出液跟踪，简化分析化验工作。缺点：开始取代操作时易引起扰乱，操作需特别小心，梯度粘度太大时也不合适。

向上取代向下取代3、虹吸法用一根聚乙烯小管插到管底部，用虹吸法吸出梯度，它也不损伤离心管，尤其适用于不锈钢管中物质的分级分离，但虹吸时易引起分离区带扰乱，最好使用专门的装置。除取代法和虹吸法外，有时从管上部直接仔细地用注射器或吸管定量移出梯度液，效果也较好。4、切割法适用于极粘梯度，就是用离心管切割器将冻结的塑料管子切成薄片，从而将梯度分部收集，此法仅适用于赛璐璐或硝酸纤维素管。（三）离心条件选择1.离心力

Fc=mac

＝mrω2

＝mr(2

N/60)2

N为离心机每分钟转数（r/min）；

Fc通常以相对离心力RCF（relativecentrifugalforce）表示，即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少倍。一般用g（或数字

g）表示。

RCF=mr(2

N/60)2/mg=1.12

10-5N2r

此公式描述了相对离心力与转速之间的关系，

旋转半径用r平均代替

r平均=1/2（r大+r小）cm通常：低速离心以每分钟的转数表示，如：4000r/min。高速离心（超速），常以相对离心力（RCF）表示，如：65000g。两者可换算或查测算图。2、离心时间不同离心方法，离心时间的概念不同。对常速离心、高速离心、差速离心,指颗粒完全沉降到离心管底的时间,沉降时间或澄清时间;等密度梯度离心,指颗粒完全到达等密度点时平衡时间，平衡时间;对密度梯度离心,指形成界限分明区带的时间，区带形成时间;沉降时间指颗粒从样品液面完全沉降到离心管底所需的时间;决定于沉降速度和沉降距离。沉降系数已知颗粒S：沉降系数；ω:角速度；r1，r2:转轴中心到液面与管底距离。效率因子KK与转子半径和转速有关；实际操作中：1、某一颗粒S定值，故K小，t也小，效率高（转子的选择）；2、转子与离心机确定，具体颗粒的ω2t是常数，故可调整ω与t得相同效果。3、温度和pH值一般为4℃。稳定性好的酶，可取室温；超高速离心需冷冻。pH值应处于酶稳定的pH范围。第二节、酶的初步分离纯化一、酶的提取二、酶的沉淀分离三、膜过滤酶的提取：是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。一、酶的提取(extraction)

提取目标：

a.将目的酶最大限度地溶解出来。

b.保持生物活性。注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，一般采用低温下（0-10℃）操作。提取原则

a.相似相溶。

b.远离等电点的pH值，溶解度增加酶的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02～0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取pH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取pH8～12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶本章目录酶的提取主要影响因素是酶在所使用溶剂中的溶解度，以及酶向溶剂相中的扩散速度。此外还受到温度、pH值和提取液体积等提取条件的影响。大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。

二、沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：

⑴中性盐沉淀（盐析法）⑵有机溶剂沉淀⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性）⑷等电点沉淀⑸有机聚合物沉淀1、盐析沉淀法（改变离子强度）（1）.基本原理（盐溶和盐析）向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：

1)盐溶（saltingin）：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。

2)盐析（saltingout）：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。在某一浓度的盐溶液中，不同的蛋白质溶解度不同，由此可达到分离的目的。蛋白质的盐析原因：高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。（2）

盐析用盐

1）中性盐的选择常用(NH4)2SO4，其突出优点：

a.溶解度大

b.分离效果好

c.不易引起变性

d.价格便宜2）盐浓度的表示

用饱和（溶解）度表示:

溶液中饱和硫酸铵的体积饱和度＝溶液的总体积3)调整盐浓度的方式

a.饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）适于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。配制饱和硫酸铵溶液所需添加饱和硫酸铵的体积可按下式计算：

V=V0

式中V,V0——为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积

S2,S1——为所需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度S2-S11-S2b.添加固体硫酸铵适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。按下式计算，得表中数据

W=

A,B——常数，与温度有关。实际使用时，可直接查表（各种饱和度下需加固体硫酸铵的量）。B(S2-S1)1-AS2（3）盐析操作低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过40％。高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。操作步骤：

1）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。

2）冰箱中（4℃）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。

3）沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltration）、透析（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。硫酸铵浓度（%）枯草杆菌

-淀粉酶发酵液的盐析曲线

（4）盐析的影响因素1)离子强度和种类（介绍盐析常数）蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：

I：离子强度，I=∑MZ2；

M：离子浓度（mol/L）；

Z：离子价数

S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L）

S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L）

Ks：盐析常数，

Ks代表盐析效率，其含义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。当温度和pH一定时，S0对于某一溶质是常数，用β表示，盐析方程式可改写为：

logS=β-KsI两种盐析法：Ks分级盐析法：在一定的pH和温度条件下，利用不同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值）的沉淀方法。β分级盐析法：在一定离子强度下，通过改变溶液的pH及温度的沉淀方法。2)蛋白质浓度：过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，2.5%-3%最好。3)pH值：等电点处最易沉淀。4)温度的影响：稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在0℃～4℃下操作。

2、有机溶剂沉淀（降低介电常数）利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。

（1）沉淀机理

降低溶液的介电常数破坏蛋白质表面水膜

（2）常用有机溶剂丙酮

乙醇

甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。

有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20℃时水的介电常数为80，而82％乙醇水溶液的介电常数为40。

溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。本节目录（3）优缺点：优点：1）分辨率比盐析法高

2）沉淀不需脱盐

3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：1）容易引起蛋白质变性失活

2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。（4）影响有机溶剂沉淀的因素

1）温度：低温（0℃）操作。

2）pH值：尽可能靠近其等电点。

3）离子强度：采用<0.05mol/L的稀盐溶液增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，目的防止蛋白质变性

4）蛋白质浓度：适当，一般为5〜20mg/ml3、等电点沉淀(isoelectricprecipitation)（1）原理蛋白质在等电点时溶解度最低不同的蛋白质具有不同的等电点

（2）使用方法单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。（3）优点：大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低无需除掉多余酸即可进行下一步纯化（4）缺点：

酸化时，容易引起蛋白质失活4、有机聚合物沉淀法

（1）作用机理：与有机溶剂类似，是发展较快的一种新方法。（2）沉淀剂：常用聚乙二醇（Polyethyeneglycol，简写PEG）多用分子量为6000～20000的PEG。（3）优点：操作条件温和，不易引起生物大分子变性。沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。沉淀后有机聚合物容易去除。5、选择性变性沉淀法

选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。

⑴热变性几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。

⑵pH变性等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。⑶有机溶剂变性使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀三、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物

质分离的技术过程。过滤介质多种多样，常用的有：滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。过滤非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质

膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质

过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同

)

类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤>2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.2～2μm细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤20Å～0.2μm病毒、生物大分子等超滤膜反渗透<20Å生物小分子、盐、离子反渗透膜膜过滤借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。根据颗粒或分子通过薄膜的原理和推动力不同分三类。1、加压膜分离以薄膜两边的流体静压差为推动力；根据截留的颗粒大小可分为3种；

微滤截留的物质颗粒直径为0.2～2um，操作压力0.1MPa以下。MEF微滤器超滤Millipore小型切向流超滤系统截留的物质颗粒直径为20～2000Å（0.2um）；可同时截留菌丝体和可溶性蛋白。

操作压力50～700KPa；特别适于液体酶制剂的生产；对需要辅酶的酶的生产不适用；一种动态过程，由泵提供推动力，在膜表面产生两个分力：一个是垂直于膜面的法向分力，使水分子透过膜面，另一个是于膜面平行的切向力，把膜面截流物冲掉。

超滤原理的示意图

常规过滤(A)和超滤(B)的示意图

AB不同形式超滤系统超滤特点超乎寻常的膜通量，且维持恒定适合处理高粘度、高含固量料液浓缩倍数极高，可使浓缩液呈糊状消除浓差极化，不易堵塞，易清洗系统可逐级拓展，中试结果完全适用于生产规模反渗透（RO

）膜孔径小于20Å，操作压力为0.7～13MPa。利用反渗透膜选择性地只能透过溶剂(通常是水)的性质，对溶液施加压力，使溶剂通过反渗透膜而从溶液中分离出来的过程。常用于去离子水的制备及海水淡化。根据膜材料和不同进料液的特性，商品应用的膜产品通常采取如下几种结构形式：管式；中空纤维；卷式；平板式。膜材料形式：膜技术

截留物尺寸nm（分子量）

推动力

分离机理

微滤MF>20(>40,000)压力差，>100kPa筛分

超滤UF1～20(10,000--40,000)压力差，>100kPa筛分

纳滤NF>1(100～1000)压力差，<1000kPa优先吸附、表面电位

反渗透RO(>100)压力差，>1000kPa优先吸附、溶解扩散

四种常用膜分离技术的基本特征四种常用膜分离过程的截留特性本节目录ReverseOsmosis(RO)Ultrafiltration(UF)Nanofiltration(NF)Microfiltration(MF)2、电场膜分离在半透膜的两侧分别装上正负极，电场作用下小分子带电物或离子向与其本身电荷相反的电极移动，透过半透膜，达到分离目的。电渗析离子交换膜电渗析应用：脱盐，海水淡化，纯水制备，从发酵液中分离柠檬酸、谷氨酸及凝胶电洗脱。用离子交换膜代替一般的半透膜。样品液缓冲液3、扩散膜分离透析膜商品透析膜大多制成管状。材料：纤维素衍生物。1）透析膜的预处理：目的：除杂质。2）透析袋的保存：防腐剂＋冷藏。第三节、酶的高度分离一、层析分离二、电泳分离二、层析分离

层析法也称色谱法，是1903年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3

吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。

色谱组分色素石油醚碳酸钙颗粒色谱起源用色彩（chroma）和图谱（graphs）组成色谱一词，（Chromatography)。层析法的基本原理利用混合物中各组分的物理化学性质(分子大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等)的差别，使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。mobilephase：携带样品流过整个系统的流体

stationaryphase：静止不动的一相层析法的分类按两相所处的状态分类：

液相层析气相层析液-液层析液-固层析气-液层析气-固层析按层析原理分类层析方法分离依据吸附层析利用吸附剂表面对不同组分吸附性能差异而使混合物中各组分分离分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对不同组分的亲和力不同，而达到分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用凝胶对相对分子质量不同各种组分的阻滞作用不同，而达到物质分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离按操作形式不同分类：柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。（一）吸附层析（adsorptionchromatography）原理利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。吸附作用的强弱主要与吸附剂和被吸附物质的性质有关。吸附层析的关键是吸附剂和洗脱剂的选择。常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。

溶剂洗脱法置换洗脱法前缘洗脱法吸附层析操作：2.吸附剂吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质的极性官能团作用。1）吸附剂的选择：根据吸附能力强弱分为：弱吸附剂：蔗糖、淀粉中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等强吸附剂：氧化铝、活性炭吸附剂的选择根据相似相溶原则：极性强的吸附剂易吸附极性强的物质非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但为了便于解吸附，对于极性强的物质通常选用极性弱的吸附剂进行吸附2）吸附剂的性质：活性炭：常用的吸附介质。硅胶：常用的极性吸附介质。羟基磷灰石（HA）

[Ca10(PO4)6.(OH)2]:

微晶型的磷酸钙制品，表面有Ca2+和PO43-两种带电基团；酸性和中性蛋白质可与Ca2+结合；碱性蛋白质可与PO43-结合。吸附原理是HA的Ca2+与蛋白质的负电荷基团作用。3.洗脱剂要求：

粘度小，纯度高，稳定性好，完全洗脱下所要分离的成分,易与目标分子分离。选择：具有较高洗脱能力的洗脱剂作为流动相。生物大分子一般选择中性盐溶液为洗脱剂。常用洗脱剂种类：饱和烃、醇、酮、酚、醚、卤代烷、水等（二）分配层析分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。分配系数：是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数。K=固定相中溶质的浓度流动相中溶质的浓度由于不同溶质有不同的分配系数，移动速度不同，从而达到分离在分配层析中，通常采用多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相。当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。纸上层析：滤纸为载体，纸上结合水为固定相，有机溶剂为流动相分配薄层层析：纤维素、硅藻土为支持物。（三）离子交换层析

（ionexchangechromatography，IEC）1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。1）离子交换剂：离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。

如羧甲基纤维素离子交换剂组成纤维素—O—CH2—COO-—Na+

载体电荷基团反离子是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。

化学原料合成：树脂类物质（酚醛树脂、苯乙烯树脂）

载体

天然材料制成：cellulosesephadex

sepharose

阳离子交换剂:电荷基团（－）,反离子（＋）电荷基团阴离子交换剂:电荷基团（＋）,反离子（－）

如：DEAE-纤维素，CM-Sepharose离子交换剂--带有电荷基团的不溶性载体-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3载体Cl-Diethylaminoethyl(DEAE)

阴离子交换剂(可吸附带负电的蛋白质)

阳离子交换剂(可吸附带正电的蛋白质)两种离子交换剂阴离子交换剂：常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基阳离子交换剂：常用羧甲基CM—CH2COO-

磺丙基SP—C3H6SO3-DEAE－C2H4N+(C2H5)2HQAE－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3离子交换葡聚糖类型说明功能基反离子DEAE-Sephadex

A-25，A-50弱碱性阴离子交换剂二乙氨基己基氯QAE-Sephadex

A-25，A-50强碱性阴离子交换剂二乙氨基己基——2-羟丙基氯CM-Sephadex

C-25，C-50弱酸性阳离子交换剂羧甲基钠SP-Sephadex

C-25，C-50强酸性阳离子交换剂磺丙基钠Ion-exchangechromatography（四）凝胶过滤层析凝胶过滤（gelfiltration）又称分子筛层析（molecularsievechromatography）、排阻层析（exclusionchromatography）,是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。1.基本原理

大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。Size-exclusionchromatography凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数Kd表示：

Ve-Vo

Kd=————ViVo——外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（ml）Vi——内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和（ml）Ve——某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（ml）凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰Ⅰ.Kd=0时,即Ve=Vo,说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最先流出。Ⅱ.Kd=1时,即Ve=Vo+Vi，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，最后流出。Ⅲ.其它组分0<Kd<1,因分子大小而改变洗脱峰的位置。Kd小的先流出，Kd大的后流出。分配系数Kd的意义：1)可定量地衡量各组分的流出顺序。2)判断分离效果，Kd差异大，分离效果好，

Kd差异小，分离效果差。2.凝胶的种类和性质1)交联葡聚糖凝胶（dextrangel)

商品名:Sephadex

型号

SephadexG－10至G-200G后的数字为凝胶吸水值的10倍。数字越大，交联度越小，孔径越大，分离范围越广。葡聚糖凝胶层析介质的有关参数凝胶型号

颗粒大小/μm

溶胀体积/(ml/g)

分离范围（Mr）

SephadexG-10

SephadexG-15

SephadexG-25

SephadexG-50

SephadexG-75

SephadexG-100

SephadexG-150SephadexG-2004～120

4～120

50～150

50～150

40～120

40～120

40～120

40～120

2～3

2.5～3.5

4～6

9～11

12～15

15～20

20～30

20～30

小于7×102

小于1.5×103

1.0×103～5.0×103

1.5×103～3.0×1043.0×103～8.0×104

4.0×103～1.0×105

5.0×103～3.0×105

5.0×103～6.0×105

2）琼脂糖凝胶（agarosegel)商品名:Sepharose

（瑞典）;Bio-GelA(美国）依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。Sepharose及Bio-gelA型号

型号

使用范围（蛋白质的分子量）含琼脂糖（℅）

6BSepharose4B2B104～3×106105～3×107106～108

642

6BSepharoseCL4B2B

同上

同上

0.5m

Bio-GelA1.5m5m15m50m150m10～500×10310～150010～500040～15000100～500001000～150000

1086421

3）聚丙烯酰胺凝胶

（polyacrylamidegel）商品名为Bio-Gel,型号从Bio-GelP－2至P-300，P值越大，孔径也越大。以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。3.操作：1）凝胶的选择和处理根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。将干胶悬浮于5~10倍的蒸馏水中，充分溶胀，抽气，装柱。2）柱的选择采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速。3）加样体积不能过多，不超过床体积的5％，脱盐时可在10％左右。4）洗脱洗脱液与平衡时用的buffer一致。洗速不可过快，保持恒速。5）胶的保存洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。用0.02%NaN3防腐。4.应用

1）脱盐２)生物大分子物质的分离纯化

3）分子量的测定

4）溶液浓缩（五）亲和层析

(AffinityChromatography)

由吸附层析发展起来的，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。

1.原理

利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA等。都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用.将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将欲分离的物质洗脱下来，实现分离提纯。亲和层析的四个要素亲和层析根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为：

共价亲和层析 疏水层析 金属离子亲和层析 免疫亲和层析 染料亲和层析 凝集素亲和层析

2.基质的选择理想的基质应满足以下要求：①高度的亲水性。②极低的非特异性吸附性（惰性）。③具有足够的化学基团。④适当的多孔性。⑤较好的理化稳定性。可被应用的基质（载体）：（按性能优劣排序）琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素。最常用的是琼脂糖，Sepharose1B到10B3.配体的选择一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体，辅酶等。优良配体须具备的条件：

1）与待纯化的物质有较强的亲和力。

2）具有与基质共价结合的基团。目的产物与相应的配基

所要分离的目的产物

相应的配基

酶抗体凝集素激素底物、抑制剂、辅酶（辅因子）抗原、病毒、细胞多糖、糖蛋白、细胞受体受体、载体蛋白4.偶联（亲和吸附剂的制备）配体一定，改造载体（基质）

1）基质活化：不同的载体活化需要不同的活化剂。常用：溴化氰（CNBr）、环氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐、苯醌等。溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。

如用CNBr

作用于葡聚糖和琼脂糖的糖羟基2）引入连接臂（spacearm）又称手臂（spacer）“接臂”的目的：

克服影响配基与生物大分子的结合的空间障碍。“接臂”的途径：常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如：AH-Sepharose4B常用手臂5.操作：1）层析前：制备亲和层析剂

根据欲分离物质特性配基

根据配基分子大小及基团特性载体2）洗脱：能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用。包括：非专一性洗脱和专一性洗脱选择选择亲和层析剂非专一性洗脱：改变温度改变pH值改变离子强度专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制剂、底物类似物）竞争性地与

配体结合被吸附物质结合6.应用1）纯化大分子物质如：纯化糖蛋白用凝集素（能可逆性地结合碳水化合物的蛋白质），Lectin-Sepharose4B2)研究酶的结构与功能：分离有生物活性与失去生物活性的蛋白质。(六)高效（压）液相层析（HPLC）特点：①使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大,因而分辨率很高。②溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。固定相（柱填料）：常用坚硬、耐高压，粒度小的硅胶。颗粒大小对分辨率的影响流速为240ml/hr流速对分辨率的影响颗粒大小为50－80目PrinciplesofOperationfor

ChromatographyTechniquesGelFiltrationIonExchangeHydrophobicInteractionAffinityReversedPhase许多类型的柱层析都可用HPLC来代替，如离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。分类

按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质分类：亲和色谱：——亲和力吸附色谱：——吸附力离子交换色谱：——离子交换能力凝胶色谱：——分子大小而引起的体积排阻分配色谱：——分配系数色谱仪组成

1）进样系统

2）输液系统

3）分离系统

4）检测系统

5）数据处理系统三、电泳分离电泳（electrophoresis,EP）：指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。电泳技术是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。原理:在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。

迁移率与内在特性和外界条件有关内在特性：颗粒性质（净电荷量，颗粒大小、形状）外界条件：电场强度、溶液性质、支持体特性电泳的分类自由界面电泳：又称移动界面电泳（movingboundaryelectrophoresis,MBEP），指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。区带电泳:（zoneelectrophoresis,ZEP）指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。区带电泳分类：按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。②薄层电泳：将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行电泳的技术。

常用的支持物有淀粉、纤维素、硅胶、琼脂等③薄膜电泳：以醋酸纤维等高分子物质制成的薄膜为支持物。医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。④凝胶电泳：以多孔凝胶作为支持物。同时具有电泳和分子筛的双重作用。具有很高的分辨率。琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率较高。电泳常用设备（1）电泳仪：为电泳提供稳定直流电源的装置。

常压电泳仪（600V）

高压电泳仪（3000V）

超高压电泳仪（30000V～50000V）（2）电泳槽：

自由界面电泳槽管状电泳槽板状电泳槽（3）附属设备：水平板式电泳槽垂直板式电泳槽（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（methylane

bisacrylamide，简称Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合的。CH2=CHC=ONH2CH2=CH

C=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：1）化学催化系统：AP-TEMED

催化剂：过硫酸铵（ammoniumpersulfate，AP）加速剂：TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）2）光催化系统：核黄素－光－（TEMED）催化剂:核黄素（维生素B2）

引发剂:光

TEMED的存在，可加速聚合。PAGE根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳（continuouselectrophoresis）采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳（discontinuouselectrophoresis）

采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系电荷效应不连续PAGE分子筛效应浓缩效应连续PAGEPAGE电泳分类浓缩胶、分离胶不连续电泳：

1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。

2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。

3.在电场中形成不连续的电位梯度。因此，在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。1）电荷效应:分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。2）分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。3）浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳是目前测定蛋白质亚基相对分子量（relativemolecularmass,Mr）的一种最好的办法。

SDSseparatesproteinsbyMW原理：SDS带有大量负电荷，与蛋白质结合后消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。

SDS破坏蛋白质构象，使蛋白质－SDS复合物形状近似棒状，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denaturedprotein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与蛋白质分子量有关。两者关系：蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bXMW：分子量；X：迁移率；k、b均为常数将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。操作1）制胶:

（变性：buffer中加0.4%SDS）

a.分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶（查表），配制分离胶溶液：

Acr:Bis=29:1，分离胶buffer,TEMED,AP,水迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完全。

b.浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。2）样品制备：

a.PAGE:样品＋样品缓冲液（蔗糖或甘油＋指示剂溴酚蓝）

b.SDS:样品＋样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸2~5min，以除去亚稳态聚合。3）加样及电泳：

SDS:电极buffer中加0.1%SDS，溴酚蓝距下端1cm时停止电泳。4）固定及染色

a.固定：将凝胶浸于7％乙酸或12.5％三氯乙酸中固定蛋白质组分。

b.染色：

考马斯亮蓝染色法

银染法（灵敏度比前者高100倍）其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸－Schiff试剂（糖蛋白（二）、等电聚焦(isoelectricfocusing，IEF)利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有各种连续

pI

的小分子混合物）的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF）。原理两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的连续的pH梯度。当酶或其它两性电解质进入此体系时，不同的两性电解质即移动到（聚焦于）与其等电点相当的位置上，从而使不同等电点的物质得以分离。两性电解质载体(carrierampholytes)(1)易溶于水，有足够的缓冲能力——以便保持稳定的pH梯度。

(2)导电性能好——以保持电场强度的均匀性。

(3)分子量小——电泳后易分离除去。

(4)化学组成不同于蛋白质——不干扰测定。

两性电解质载体是由许多种多烯多胺（如五乙烯六胺等）与丙烯酸进行加成反应而制备得到的混合物。目前有商品出售，如Ampholine,Phamalyte等。等电聚焦电泳

操作：

1）凝胶配制：凝胶浓度T为5％~7.5％（C=3%左右）

2）加样：任意位置

3）电泳：