翠贻贝对腹泻性贝毒的累积与排出

翠贻贝对腹泻性贝毒的累积与排出

大明软海绵酸（oa）是ae级腹泻性骨关节病（pd）的主要毒素类型。这是蛋白质磷酸酶pp1（protectionpharmace）和pp2a（sertorreprotectionpharmace2a）的特定抑制剂。由于其特定的化合物，它可以抑制许多酶的去除磷酸化，导致信号传导路径的变化和身体疾病。爱贝、贝贝或其他双壳类动物可以通过过滤食物中的毒藻来积累sd，但对贝类本身的生存影响不大。即使以毒藻为唯一的食物来源，死亡率也不会显著增加。这表明贝体体内存在一种特殊的耐碱或抗碱机制，这使贝体本身不会受到腹泻性贝毒的伤害。sd耐受性和抗碱机制对研究具有重要的实用价值和理论意义。作为多生物异源物质抗性机理(multixenobioticresistance,MXR)的重要组成部分,具有上调修复机制的热激蛋白70(heatshockprotein70,HSP70)广泛分布于各种生物体内,在生物体对环境胁迫和外源物质的抗性与耐受机制中发挥重要作用.研究发现,HSP70在热激、高温、紫外线、微量金属、异源物质(如细菌,毒素)都能诱导其表达,由于HSP70的高度保守性、同源性及胁迫诱导的广谱性,因此受污染土壤和海洋中的生物所产生的HSP可作为机体受到环境胁迫的标记,并进一步用于环境的监测和分析.但贝毒素能否诱导HSP的表达,HSP在贝类抗贝毒机制中是否发挥某种重要作用?目前国内外均未见报道.本研究以利玛原甲藻为饵料,通过室内滤食实验,考查了DSP在翡翠贻贝体内的累积与排出规律,分析了HSP70基因的表达与毒素累积与排出之间的关系,探讨了DSP毒素对HSP70基因表达的影响,为进一步明确HSP70在贝类抗DSP毒素中的作用奠定基础.1材料和方法1.1角褐脂藻phaceodagctraft利玛原甲藻(Prorocentrumlima)由美国CCMP(Provasoli-GuillardNationalCenterforCultureofMarinePhytoplankton)提供,编号2597.三角褐脂藻(Phaceodactylumtricornutum)由暨南大学赤潮与水环境研究中心提供.翡翠贻贝(Pernaviridis)采自广东珠海海域.1.2仪器和检测方法海盐(Aquasonic,Ingieburn,N.S.W.,Australia);维生素VB1、维生素VB12和生物素(上海伯奥生物科技有限公司);Trizolreagent(Invitrogen);MMLVReverseTranscriptaseRnaseH(TOYOBO);Ribonucleaseinhibitor,TakaraLATaq和Sampleprotector(Takara);DSP检测试剂盒(Abraxis).其他未注明试剂均为国产分析纯.353型酶标仪(LabsystemsMultiskanMK);CKX41倒置生物显微镜(Olympus);CD2105智能生物人工气候箱(Xutemp,杭州雪中炭恒温技术有限公司);PCR扩增仪(Bio-rad);凝胶成像系统(MultiGenius).1.3实验方法(1)培养基的设置利玛原甲藻和三角褐脂藻的培养均采用f/2培养基,置于温度(22±1)℃,光照强度4000lx、光暗循环为L∶D=12∶12的人工气候箱中进行扩大培养.(2)饲养繁殖与培养将翡翠贻贝置于海水(25‰)中驯养,连续充气,每天换水一次,驯养饵料使用三角褐脂藻,饲养密度约20只/20L,使贝保持良好的生理状态.(3)实验贝的干质量实验设5组,投喂不同体积比的利玛原甲藻和三角褐脂藻(0∶100,30∶70,50∶50,70∶30,100∶0).其中全部喂饲利玛原甲藻的藻密度为105/L,全部喂饲三角褐脂藻的藻密度为106/L.空白对照不加贝类,每组设3个平行,置盛有4L海水的大烧杯内饲养,氧气泵充气,实验时间为1h.实验结束后取水样计数,称实验贝的干质量.滤食率的计算公式为:G=V·(lnCt-lnCtf)·(Ctf-C0)/[N·W·t·(lnCtf-lnC0)]式中,G为滤食率[个/(g·h)],即单位质量单位时间过滤的饵料细胞数;V为食物溶液体积(L);W为实验贝软组织的质量(g);N为实验贝数;Ctf为实验瓶中的剩余食物量(个/L);C0为起始食物量(个/L);Ct为对照瓶中的最终食物量(个/L);t为摄食时间(h).(4)角褐脂藻的饲养选取经驯化饲养的、大小均一的90只贻贝,分3组,分别投喂不同体积比混合的利玛原甲藻和三角褐脂藻(0∶100,30∶70,70∶30),相应藻密度与1.3(3)节相同.3d后全部喂饲三角褐脂藻,继续饲养3d.实验周期内每天取贝样,每组6只.迅速开壳,摘取鳃组织,并将其分成2份.一份置于含Sampleprotector的EP管中,5min后放入-80℃冰箱保存.一份保存于-20℃冰箱用于毒素的分析.(5)毒素含量测定毒素的测定采用酶联免疫试剂盒.取1g贝组织与体积分数80%的甲醇混匀、离心,取上清,定容到10mL.取其中的10μL,用样品稀释液稀释到1mL.加入100μL稀释样品到检测孔中(标准和样品均做3个平行),依次加入50μL的酶偶联液、抗体溶液,转匀,室温孵育1h.用洗液洗3次,在吸水纸上拍干,加入150μL底物溶液,室温孵育30min,加入100μL停止液,450nm下读板,绘制标准曲线,计算样品中毒素的含量.(6)pcr扩增条件的确定采用Trizol法提取鳃组织总RNA,用体积分数1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性.cDNA合成总体系25μL:1～5ngRNA,1μLRandomprimer,65℃15min,冰浴5min;然后加入5μL10mmol/LdNTP,5μL5×buffer,0.5μLRibonucleaseinhibitor,1μLMMLVReverseTranscriptaseRnaseH,5.5μLRNase-freeH2O.混匀,42℃温浴1h,99℃5min使酶灭活.用于HSP70扩增的引物参考文献,上游引物为:GACTTGGGTGGTGGAAC,下游引物为:GGCTACAGCTTCATCAGGG,片段大小为516bp.18SrRNA作为内参,引物参考文献,上游引物:GGTTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCCTG,下游引物:GATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACC,片段大小为1700bp.PCR反应体系20μL,上下游引物各0.5μL,10×LATaqbuffer2μL,LATaq酶0.2μL,cDNA2μL,双蒸水14.8μL.为保证PCR扩增在线性范围内进行,需首先确定合适的模板量与PCR循环数.根据实验结果,18S的扩增条件确定为:模板量4ng;94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸2min,共30个循环.最后1个循环后于72℃延伸10min.HSP70的反应条件为:模板量8ng;94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火40s,72℃延伸40s,共30个循环.最后1个循环后于72℃延伸10min.扩增产物用体积分数2%琼脂糖凝胶电泳后成像.2结果2.1不同投喂材料对贻贝滤食率的影响整个实验过程中,翡翠贻贝死亡2只,对照组(0∶100)和实验组各1只.喂养毒藻的实验组均未观察到明显的不良反应.图1为喂饲利玛原甲藻后翡翠贻贝滤食率的变化情况.从图中可以看出,随着投喂毒藻在混合藻液中比例的增加,贻贝对藻细胞的滤食率明显降低,呈现明显的剂量-效应关系.对照组和实验各组的滤食率分别为1.43×105、1.24×105、0.82×105、0.54×105、0.32×105/(g·h).表明利玛原甲藻可显著抑制贝类的滤食,这可能是贝类为减少毒藻暴露而采取的一种保护性行为.2.2两组各克氏原螯虾dsp的质量分数DSP在贻贝鳃组织中的累积与排出情况如图2所示.从图中可以看出,前3d翡翠贻贝鳃组织中DSP毒素显著增加,呈明显的剂量和时间依赖关系.第2、3天时,30∶70实验组鳃组织中DSP的质量分数分别为164.5、216.5ng/g;70∶30实验组分别为182.4、254.8ng/g;均明显高于对照组(0∶100)(P<0.05).后3d,贻贝体内毒素含量显著下降.最后1d时,毒素水平下降至染毒第一天的水平,表明贻贝排出毒素的能力比较强.需要说明的是,即使未染毒贝,鳃组织中也有一定的毒素检出,表明贝自身已在自然海域中染毒,只是毒素浓度较低而已.这与杨莉等的调查结果是一致的,说明广东沿海贝类DSP毒素污染状况比较严重.3.3hsp60基因表达量的检测根据确定的PCR条件,以18S为内参对HSP70基因进行半定量RT-PCR分析,结果如图3所示.进一步用Bandscan软件对电泳结果进行半定量分析,结果如图3、表1所示.从图表可以看出,随着毒素的累积HSP70表达显著增加,并于第2天达到高峰,30∶70实验组和70∶30实验组表达分别是对照组的4.89、6.31倍.后3d,随着毒素从体内逐渐清除,HSP70基因表达量呈降低的趋势.3讨论3.1利玛原甲藻的滤食率许多研究证实,短期暴露于有毒甲藻中时,贝类的滤清率(或摄食率)会显著下降.朱明远等指出,给栉孔扇贝全喂PSP产毒藻微小亚历山大藻比全喂三角核脂藻的滤食率降低了1倍;Bauder等的研究结果显示,海湾扇贝滤食率随着利玛原甲藻的浓度升高呈降低趋势.一般而言,对毒素敏感的贝类往往排斥作用较强,毒素积累比较少;相反,对毒素不敏感的贝类往往对毒素有较高的累积能力,毒素的排出也慢.贝类暴露于产毒藻细胞时,滤清率的变化可直接反映出该贝对毒素的敏感性,并能指示随后的毒素积累情况.本研究发现,翡翠贻贝暴露于产毒利玛原甲藻后,其滤食率显著下降,存在明显的剂量-效应关系,表明翡翠贻贝对DSP毒素比较敏感.3.2利玛原甲藻的监控不同贝类对DSP毒素的积累能力和排出能力不同.Viviani等研究指出,特定海域中,紫贻贝最易积累DSP毒素,体内毒素累积最高;扇贝体内次之,牡蛎体内毒素积累最少.Bauder等观察发现,用105/L的利玛原甲藻喂养海湾扇贝(Argopectenirradians)2d,鳃中DSP贝毒的累积最高为0.2μg/g;本研究显示,翡翠贻贝喂食利玛原甲藻后,第3天可达254.8ng/g,与海湾扇贝情况类似.一般而言,贝类中毒素的清除速率由快到慢,特别是前3d排出速率相对较快,而后转入缓慢的排毒阶段.Bricelj和Shumway按照毒素排除速率,将双壳贝类划分为慢速排毒者(排除率≤3%),快速排毒者(3%<排除率<15%).本研究发现,翡翠贻贝体内DSP的排除率平均12%.按照这一标准,应属快速排毒者.说明翡翠贻贝对利玛原甲藻敏感性高,能通过自净逐渐排除毒素.3.3hsp70表达变化热激蛋白70广泛分布于各种生物体内,具有短时性、高度的保守性、多样性等特点,具有分子伴侣功能,使生物获得耐热性、调控细胞骨架动力学及调控基因表达(即上调修复机制)等,可作为机体受到环境胁迫的标记.目前有关环境胁迫诱导HSP70的表达研究主要在蛋白表达水平上,mRNA水平上研究甚少.研究表明,双壳贝类35℃热激1h后,随着时间的延长,HSP70表达量明显上升,但1h出现短暂的降低,3h表达水平最高,24h后表达水平居高不下;暴露于0.75μmol/LHg2+6d,8h时HSP70表达水平均达到最高,6d后恢复正常水平;注射细菌Vibrioanguillarum后,48h时HSP70表达水平最高;而暴露于有机汞时,HSP70表达水平表达受到显著抑制.本研究探讨了翡翠贻贝暴露于不同水平