【知识精讲精研】高三生物一轮复习课件微生物培养与发酵工程

生物学技术与工程专题第一讲：微生物的培养与发酵工程第二讲：细胞工程与胚胎工程第三讲：基因工程

·上第四讲：基因工程

·下第五讲：酶工程、凝胶电泳与色谱、DNA粗提与鉴定等01.培养基02.无菌技术03.微生物的培养04.发酵工程本节看点1.理解代谢类型不同微生物的培养要求2.区分碳源与能源的差异3.区分选择培养基与鉴别培养基微生物的代谢类型微生物：一般指直径小于0.1mm的生物营养类型碳源能源举例光能自养型化能自养型异养型氧化NH3

NO2−

氧化

− NO3附：硝化细菌的自养方式C6H12O6

合成放能放能CO2光能蓝藻等CO2化学能硝化细菌、硫化细菌等有机物化学能真菌、病毒、原生动物等培养基的化学成分成分作用碳源无机碳源：

CO2，

NaHCO3等①用于合成微生物的细胞物质和一些代谢产物②异养型微生物的主要能源物质有机碳源：糖类，脂肪酸等注意：

碳源

≠

能源如光能自养型微生物(蓝藻)的培养中，

CO2作为碳源，但其能源来自于光能培养基的化学成分成分作用碳源无机碳源：

CO2，

NaHCO3等①用于合成微生物的细胞物质和一些代谢产物②异养型微生物的主要能源物质有机碳源：糖类，脂肪酸等氮源无机氮源：

N2，

NH3

，硝酸盐等用于合成蛋白质、核酸和含氮的代谢产物有机氮源：尿素，牛肉膏蛋白胨等牛肉膏：

是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色蛋白胨：

将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，具有肉香的特殊气息。蛋白质经酸、碱或蛋白酶分解后也可形成蛋白胨注意：1.

某些微生物可以利用氮源作为能源，如硝化细菌2.某些既含碳元素又含氮元素的物质(如牛肉膏蛋白胨等)可以同时提供碳源和氮源3.

牛肉膏主要为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素培养基的化学成分成分作用碳源无机碳源：

CO2，

NaHCO3等①用于合成微生物的细胞物质和一些代谢产物②异养型微生物的主要能源物质有机碳源：糖类，脂肪酸等氮源无机氮源：

N2，

NH3

，硝酸盐等用于合成蛋白质、核酸和含氮的代谢产物有机氮源：尿素，牛肉膏蛋白胨等水H2O①作为溶剂溶解营养物质②调节溶液浓度，维持渗透压③为培养对象的生存提供相应的水环境无机盐磷酸盐，

硫酸盐，

钾

、钙，

钠，

镁，铁等盐类①维持渗透压②维持生物大分子和细胞结构的稳定性③某些微生物的生长能源物质铁细菌：

一类生活在含有高浓度二价铁离子的池塘、湖泊、温泉等水域中，能将二价铁盐氧化成三价铁化合物，并能利用此氧化过程中产生的能量来同化二氧化碳进行生长的细菌的总称培养基的化学成分成分作用碳源无机碳源：

CO2，

NaHCO3等①用于合成微生物的细胞物质和一些代谢产物②异养型微生物的主要能源物质有机碳源：糖类，脂肪酸等氮源无机氮源：

N2，

NH3

，硝酸盐等用于合成蛋白质、核酸和含氮的代谢产物有机氮源：尿素，牛肉膏蛋白胨等水H2O①作为溶剂溶解营养物质②调节溶液浓度，维持渗透压③为培养对象的生存提供相应的水环境无机盐磷酸盐，

硫酸盐，

钾

、钙，

钠，

镁，铁等盐类①维持渗透压②维持生物大分子和细胞结构的稳定性③某些微生物的生长能源物质生长因子维生素、氨基酸、碱基、嘌呤、嘧啶、生物素、烟酸等一般是酶和核酸的组成成分注意：

培养基中必须具备生长因子，但未必需要“单独添加”培养基的类型液体培养基：主要用于工业生产、扩大化培养及动物细胞培养不加凝固剂固体培养基：主要用于微生物的分离、纯化、鉴定、计数等加入较多的凝固剂，如琼脂或明胶半固体培养基：

主要用于观察微生物的运动加入较少的凝固剂物理状态天然培养基：如牛肉膏-蛋白胨培养基、锯末培养基、牛粪培养基等人工合成培养基：

如MS培养基等化学成分培养基的类型——依照功能分类根据微生物的特殊营养需求配制培养基或加入某种化学物质，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长常用于培养、分离特定微生物※

选择培养基

※类型1

：根据微生物特殊营养需求1.

以纤维素为唯一碳源——分离纤维素分解菌2.

以尿素为唯一氮源——分离尿素分解菌3.

缺乏单独添加氮源——分离固氮菌类型2：加入化学物质抑制或杀死其他微生物1.

加入青霉素——分离真菌2.

加入高浓度食盐——分离金黄色葡萄球菌3.

加入10%酚——分离放线菌培养基的类型——依照功能分类培养基中加特定化学物质，某种微生物生长代谢产物可与培养基中化学物质发生反应，产生特征性变化主要用于微生物快速分类鉴定和筛选产生某种

代谢产物的微生物菌种※

鉴别培养基

※加入显色指示剂或显形指示剂如伊红-美蓝、刚果红、酚红、明胶等鉴别不同种类微生物图为伊红-美蓝培养基培养大肠杆菌效果培养基的类型——依照功能分类常见的鉴别培养基培养基名称用途加入化学物质微生物代谢产物培养基特性变化伊红-美蓝培养基鉴别大肠杆菌伊红、美蓝酸性物质黑色刚果红培养基鉴别纤维素分解菌刚果红纤维素酶透明圈酚红培养基鉴别尿素分解菌酚红脲酶培养基变红明胶培养基鉴别产蛋白酶菌株明胶胞外蛋白酶明胶液化纤维素分解菌释放纤维素酶分解菌落周边纤维素使其变为葡萄糖供自身利用注意：“透明圈”的理解与使用刚果红

+

纤维素

=

红色AB透明圈半径菌落半径越大效果越好培养基配置的基本原则细菌、放线菌——6.5~7.5酵母菌、霉菌——4.5~6营养全面、协调：碳源、氮源、水、无机盐、生长因子目的明确：分离？鉴别？选择？扩大化培养？控制pH条件配制原则灭菌处理01.培养基02.无菌技术03.微生物的培养04.发酵工程本节看点1.理解灭菌与消毒的核心区别2.理解常见的灭菌与消毒操作无菌技术项目条件结果常用方法应用范围消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部部分对人体有害的微生物不包括芽孢和孢子煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法不耐高温的液体化学药剂消毒法用75%酒精擦拭双手用氯气消毒水源等芽孢又称内生孢子，是细菌休眠体。芽孢含水量极低，抗逆性强，能经受高温、紫外线，电离辐射以及多种化学物质灭杀等孢子是脱离亲本后能直接或间接发育成新个体的生殖细胞。它是有丝分裂或减数分裂的产物；多数为单倍体，少数为二倍体芽孢外膜芽孢壳核芯皮层芽孢壁芽孢内膜无菌技术项目条件结果常用方法应用范围灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有微生物包括芽孢和孢子湿热灭菌法(高压蒸汽灭菌法)培养基及容器的灭菌干热灭菌法玻璃器皿及金属工具灼烧灭菌法接种工具干热灭菌箱干热灭菌：

160−170

℃下加热1−2h高压蒸汽灭菌锅100kPa

、121℃下维持15−30min。灼烧灭菌(酒精灯)01.培养基02.无菌技术03.微生物的培养04.发酵工程本节看点1.理解培养基的配制流程2.理解单菌落的定义及其获得方式3.掌握平板划线法的基本操作4.理解稀释涂布平板法的计数规则5.区分菌种保藏的不同方式培养基的配置流程

灭菌

倒平板

平板倒置计算

称量

溶化

调pH牛肉膏(膏状物)称量纸注意：由于牛肉膏为膏状物(粘稠)，所以在称量之后须连同称量纸一起进入溶化步骤培养基的配置流程

灭菌

倒平板

平板倒置计算

称量

溶化

调pH②③④①1.

将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左后拔出棉塞2.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰3.

用左手拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10~20ml)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿皿盖4.

等待平板冷却凝固，大约5~10min。然后将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上

培养基的配置流程

灭菌

倒平板

平板倒置计算

称量

溶化

调pH注意：

平板倒置的目的平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠。将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免

培养基中水分过快的蒸发补充：接种前：防止培养基与培养皿脱离；易于拿取接种后：减少空气流通；防止失水干裂；防止杂菌污染；利于营养物质的富集与吸收；防止菌落过

快扩散，方便计数平板正置平板倒置单菌落由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体单菌落分离：在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征大小、形态、隆起程度和颜色培养∴

形成单菌落的核心，是让每个微生物之间在培养基上的“距离”变大微生物B微生物A培养平板划线法接种环酒精灯菌液①将接种环放在火焰上灼

烧，直到接种环烧红在火焰旁冷却接种环，

并打开棉塞将试管通过火焰②③④将已冷却的接种环伸入

菌液中，沾取一环菌液将试管口通过火焰，并

塞上棉塞⑤⑥⑦左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖，注意不要划破培养基灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划

线的末端开始往第二区域内划线。重复以

上操作。在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连平板划线法接种环酒精灯菌液冷却再插，烧后再画头尾不连，用力不大平板划线法接种环酒精灯菌液冷却再插，烧后再画头尾不连，用力不大注意：

平板划线法可以对微生物进行分离、纯化、鉴定，但无法计数稀释涂布平板法将涂布器浸入盛有酒精的烧杯中取少量菌液(一般

为0.1mL)滴加到培

养基表面将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后冷却8-10s用涂布器将菌液均与的

涂布在培养基表面，涂

布时可转动培养皿，使

菌液涂布均匀①②③

④

⑤

⑥涂布器①②③④思考：1.

稀释液的要求2.

稀释倍数的选择3.

同一稀释梯度实验次数

4.

是否需要空白对照5.

统计结果可靠性6.

与血球计数板的对比稀释涂布平板法注意：1.

稀释液要严格保证无菌，所以一般采用无菌水进行稀释。

2.

涂布平板用菌液量一般为0.1ml3.

通常选择一定稀释范围的样液培养，保证菌落数在30~300之间

4.

同一稀释度的对照平板不少于3个，且菌落数不应相差很大5.

设置空白对照实验，提高实验结果的可信度6.相较于血球计数板，稀释涂布平板法只对活菌计数

7.

统计的菌落数往往比活菌实际数目偏小将涂布器浸入盛有酒精的烧杯中取少量菌液(一般

为0.1mL)滴加到培

养基表面将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后冷却8-10s用涂布器将菌液均与的

涂布在培养基表面，涂

布时可转动培养皿，使

菌液涂布均匀①②③

④

⑤

⑥涂布器①②③④菌种保藏方法操作目的频繁使用的菌种临时保藏①菌种接种到试管固体斜面培养基上，适宜温度培养②菌落长成后将试管放入4℃冰箱中保藏③每隔3~6个月，转移菌种至新培养基注意：临时保藏菌种易被污染或产生变异保持菌种的纯净长期保存甘油管藏①3ml甘油管中装入1ml甘油，灭菌②将1ml培养的菌液转移到甘油管中与甘油充分混合③将甘油管放入-20℃冷冻箱中保存增大接种面积，创造合适的条件固体斜面培养基常见微生物生长的影响因素环境因素影响机理最适条件不适宜因素导致结果温度影响蛋白质和核酸结构25~37℃低温时反应速率降低；高温时蛋白质和核酸结构被破坏pH影响酶活性和膜稳定性细菌：

6.5~7.5真菌：

4.5~6.0酶活性或膜稳定性改变；新陈代谢受阻氧气影响微生物呼吸作用或生命不同微生物所需条件不同①严格厌氧型：短时间有氧造成生长停滞或死亡②兼性厌氧型：无氧时无氧呼吸，有氧时有氧呼吸③好氧型：无氧条件下难以生存微生物的生长规律01.培养基02.无菌技术03.微生物的培养04.发酵工程本节看点1.理解传统发酵技术的原理2.理解各菌种的代谢类型3.掌握亚硝酸盐鉴定的基本方式传统发酵技术——果酒菌种代谢

类型发酵原理发酵条件注意事项物质鉴定果

酒酵母菌(真核)异养兼性

厌氧有氧呼吸细胞增殖酵母菌有氧呼吸增加细胞数量无氧呼吸酒精发酵酵母菌无氧呼吸产生酒精与CO2T:18-25℃pH:5-61.实验器具70%酒精消毒

2.葡萄先冲洗后去梗3.果汁量不高于发酵瓶2/34.注意及时排气5.果酒酒精浓度不高于14%酸性重铬酸钾橙黄

→灰绿选取葡萄冲洗榨汁发酵10-12天1.

葡萄先冲洗后去梗——

防杂菌污染2.70%酒精对器皿消毒3.

先发酵瓶留1/3空间——先有氧增殖

（或者先通气后密封也可）4.发酵过程控温18-25℃5.

发酵过程严格密封6.

果酒浓度一般不超过14%

（酵母菌会死亡）7.

注意定期排气

（排出CO2）8.

生成物检测：

酸性重铬酸钾——橙黄

→

灰绿酵母菌传统发酵技术——果醋菌种代谢

类型发酵原理发酵条件

注意事项物质鉴定果

醋醋酸杆菌(原核)异养需氧

型糖源充足

糖

醋酸糖源不足酒精

醋酸T:30-35℃O2

充足全通气果醋鉴定1.

有糖用糖，无糖用酒2.发酵过程控温30-35℃3.

持续通氧

（无菌空气是最经济的选择）4.

果醋的鉴定方法①观察菌膜的形成②嗅味和品尝③比较发酵前后的pH选取糖源

冲洗

榨汁

发酵7-8天醋酸杆菌传统发酵技术——腐乳菌种代谢

类型发酵原理发酵条件注意事项物质鉴定腐乳毛霉(真核)异养需氧

型酶的催化1.蛋白酶Pr

氨基酸

+多肽2.脂肪酶

脂肪

甘油

+

脂肪酸T:15-18℃1.豆腐含水量70%2.加盐调味并析出豆腐水分3.越接近瓶口盐量越大4.盐浸提毛霉菌丝的蛋白酶

5.卤汤含12%酒精，抑菌

6.香辛料调味，抑菌——1.

豆腐含水量70%左右（否则易碎）2.

发酵过程控温15-18℃3.加盐调味并析出豆腐水分，防止酥烂4.

越接近瓶口，盐量越大

（防杂菌污染）5.加盐还可以浸提毛霉菌丝的蛋白酶6.

卤汤中加12%酒精，抑制微生物生长7.

香辛料调制风味，防腐杀菌8.

封瓶时将瓶口通过酒精灯火焰，防止污染豆腐上长出毛霉

加盐腌制

加卤汤装瓶密封腌制毛霉传统发酵技术——泡菜菌种代谢

类型发酵原理发酵条件注意事项物质鉴定泡菜乳酸菌(原核)异养厌氧型乳酸菌无氧呼吸T:20℃1.5%~20%盐水2.盐水煮沸后冷却2.泡菜坛严格密封3.标准显色液现用现配亚硝酸盐鉴定

发酵

成品盐水没过全部菜料泡菜坛严格密封坛盖边沿水槽中注满水称取

食盐配制

盐水泡菜

盐水修整、洗涤、晾晒

切分成条状或片状加入调味

料，装坛亚硝酸盐

含量测定选择原料

乳酸杆菌/链球菌5%~20%浓度盐水，煮沸后冷却盐调味抑菌；煮沸杀菌，冷却为保乳酸菌存活亚硝酸盐的鉴定亚硝酸盐是一种分布广泛的食品添加剂，低剂量不危害人类健康，大部分随尿液排出亚硝酸盐在适宜的pH、温度和一定的微生物作用会转化为亚硝胺亚硝胺具有致癌作用，对动物具有畸形和突变作用