猪源链球菌溶血素的测定与分析

猪源链球菌溶血素的测定与分析

猪链霉菌受到严重影响，是中国养猪业多年来最常见的疾病之一。1998年夏,江苏某地猪群暴发了猪链球菌2型(Streptococcussuistype2)引致的急性败血性传染病,死亡率达39.7%,造成了巨大的经济损失,并对人民健康造成了严重威胁。本试验在对近几年从江苏和上海地区分离的猪源链球菌的溶血活性进行了检测。1材料和方法1.1马球兽疫物种streptocco权从江苏、上海等地的病猪分离猪源链球菌13株、1株猪链球菌2型参考菌株SS2-D(德国吉森大学Baljer教授惠赠)、5株马链球菌兽疫亚种(Streptococcusequisubsp.zooepidemicus)菌株,后者属链球菌兰氏(Lancefield)分群C群,系从患败血症死亡的病死猪分离,其中ATCC35246(以下简称35246),购自美国菌种保藏中心,其余4株由上海市畜牧兽医站提供。菌株来源等参见表2。1.2种子液培养模式挑取35246单菌落,接种于THB,37℃静置培养18～24h制成种子液。试验时按1%的比例移种至不同培养基中,置不同条件下培养。溶血价的测定按文献的方进行(下同)。1.2.1血清浓度将种子液分别接种于THB、2%血清THB(含2%犊牛血清的THB,下同)和5%血清THB,置37℃静置培养12h测溶血价。1.2.2营养猪肉和血清丁血的测定将种子液分别接种于5%血清THB、5%血清营养肉汤(NB)、5%血清马丁肉汤(MB),置37℃静置培养,接种后6,12,18,24,30,36和48h分别取样测溶血价。1.2.3碱性将种子液分别接种于pH为6.5,7.0,7.5,8.0和8.5的5%血清THB,37℃静置培养12h,测溶血价。1.2.4气体环境将种子液接种至5%血清THB(pH为7.5)后,分别在振荡通气(110r/min)及静置气体环境下培养12h,测溶血价。1.3猪源链的溶血性检测1.3.1血液中脂酸将各菌株划线接种于5%兔鲜血琼脂平板,置37℃培养24h后观察结果。菌落周围出现溶血圈者,判为溶血阳性。1.3.2疫种和猪链球菌的溶血素检测按照1.2部分确定的条件和文献报道的方法,分别检测马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型的溶血素,即将各待测菌株接种于THB中,于37℃培养18～24h制成种子液,然后按1%的接种量分别接种于THB和含5%犊牛血清的THB中,置37℃培养12h后测血价。1.3.3各种溶剂溶剂对血溶胶的影响在各菌株5%犊牛血清THB培养液上清中分别加入还原剂二硫代苏糖醇(DTT)(上海大境生化制品经营部)、氧化剂过氧化氢(南京金陵化工厂)、溶血抑制剂胆固醇(上海生物化学试剂公司)、卵磷脂(华东师范大学化工厂),使之终浓度分别为5mmol/L,0.1%(v/v),100g/mL,100g/mL置室温(25℃)作用30min后,分别测溶血价。2结果2.1培养条件对马草酸亚洲酚的产量的影响2.1.1血清浓度35246在THB、2%血清THB和5%血清THB中的溶血价分别为0、32和64。2.1.2血清nb、血清b中血清mb中最低培养基的种类对溶血素产量影响极大,在5%血清THB中最高,达64,其次为5%血清MB,达16,5%血清NB中最低,仅为4。培养时间对溶血素的产量影响也很大,其产量在接种后12h,达到高峰(表1)。2.1.3血清thb蛋白表达情况35246在pH为6.5,7.0,7.5,8.0和8.5的5%血清THB中的溶血价分别为8,16,64,32,16和4,可见pH为7.5时,溶血价最高。2.1.4气体环境对溶血素产量的影响在静置条件下培养溶血价为64,而在振荡通气条件下,溶血价仅为16。2.2配用mthb的活性所有7株猪链球菌2型菌株在血平板上的溶血性较弱,仅为α或弱β溶血,但在THB和5%血清THB中都可产生很强的溶血性;其溶血性可被还原剂活化,被氧化剂和胆固醇所抑制,卵磷脂对其活性则没有影响。9株马链球菌兽疫亚种菌株在血平板上的溶血性很强,呈显著的β溶血,在不含血清THB中不能产生溶血性,在含血清的THB中可产生较强的溶血性,其活性不被还原剂活化,不被氧化剂抑制,被胆固醇抑制大部分活性,而被卵磷脂全部抑制。非典型C群链球菌上海分离株SH0066531和SH0066532在血平板上呈显著的β溶血,在液体培养条件下显示了非常强的溶血性,溶血价达512,而且其活性不被还原剂活化、不被氧化剂抑制,也不被卵磷脂抑制,但被胆固醇强烈抑制。检测结果见表2。3溶血素的致病性检测很多链球菌都可产生溶血素,其中A群链球菌溶血素的研究较深入。A群链球菌可产生两种溶血素,一种对氧敏感,遇氧失活,称为SLO(StreptolysinO),另一种对氧不敏感,称为SLS(StreptolysinS)。SLO能被胆固醇强烈抑制,SLS只在含有SLS诱生剂如血清、RNA的培养基中才能产生,SLS被胆固醇抑制部分活性,被卵磷脂和台盼蓝强烈抑制。根据本试验溶血素检测的结果,可判定本试验所测的8株猪链球菌2型菌株的溶血素属于巯基活化类(类SLO)溶血素,9株马链球菌兽疫亚种菌株所产生的溶血素属于类SLS,还有两株非典型C群链球菌所产生的溶血素属于非SLO、非SLS溶血素。马链球菌兽疫亚种曾经是我国猪链球菌病的主要病原,但其产生的溶血素属于何种类型的溶血素,一直未见报道。本试验表明,马链球菌兽疫亚种猪分离株溶血素属于类SLS溶血素,与Suzuki报道的马链球菌兽疫亚种松鼠分离株以及Flangan报道的马链球菌马亚种的溶血素的一致。尽管马链球菌兽疫亚种的3个菌株35246、JS01和ST171的毒力差异很大,对小鼠的LD50分别为104.0、105.5和107.3(待发表资料),但本试验发现它们在血平板上和液体培养基中的溶血性都没有明显差异,提示该菌除溶血素外,可能还有其它重要致病因子。溶血素是细菌一种常见的致病因子,对其进行准确、快速的检测,具有很大的实际意义。溶血素检测方法最常用的为平板法和上清法。平板法是一种最简便的方法,但具有很大的局限性。例如,猪链球菌2型在血平板上的溶血性比马腺疫链球菌兽疫亚种弱很多,但在各自最合适的液体