乳酸杆菌的研究进展

乳酸杆菌的研究进展

蘑菇是人类和动物肠道中非常重要的寄生虫之一。这种菌是一种双性厌氧的红景天菌。这是一家重要的食品和医疗工程领域微生物，包括三种类型的乳酸菌、乳酸杆菌和双壳菌。20世纪80年代,人们开始致力于乳酸菌生物学性质和分子机制的研究,乳酸杆菌在农业、食品领域所具有的重大经济意义及对人体和动物健康的重要性,越来越引起人们的关注。随着乳酸杆菌分子生物学的发展和电转基因技术的建立,以及各类表达调控元件的分离和克隆,已经建立和发展了一系列乳酸杆菌基因表达载体和传递系统,为探索其新的应用潜力提供了基础,其中利用乳酸杆菌作为抗原传递载体进行粘膜疫苗免疫的研究,是该领域研究的前沿和热点。本文主要对乳酸杆菌表达系统方面的进展作一综述。1微生物指标菌乳酸杆菌作为主要的益生菌广泛应用于食品及饲料加工业,在功能食品、医疗保健、微生态制剂等领域的应用具有诱人的前景。目前,乳酸杆菌制剂已被应用于肠道的微生态治疗。乳酸杆菌另一个在医学领域具有应用潜力的是作为免疫接种的疫苗载体。乳酸杆菌作为外源基因表达宿主菌,其优越性主要表现在:①乳酸杆菌能在呼吸系统、消化系统、泌尿系统定植,对维持微生态平衡具有重要作用;②在食品工业各个领域中长期应用已证实不具有致病性,被公认为安全级(GRAS,generallyrecognizedassafe)微生物,身为食品级细菌,易构建成食品级的基因克隆及表达系统,可以有效提高基因工程产品的安全性,并可在一定程度上简化表达产物的后期处理工艺;③具有控制肠道感染、增加某些食物的营养价值、控制血清胆固醇水平、改善乳糖代谢、诱导体内特异性及非特异性免疫应答以及抗肿瘤活性等功能;④同肠胃外免疫途径相比,通过黏膜免疫,可以诱发IgA产生;⑤具有免疫佐剂作用、固有免疫原性及对胆汁酸的抵抗力。因此,乳酸杆菌作为基因工程受体菌的应用前景十分广阔。2糖代谢的发生乳酸杆菌的许多种类中均发现有质粒的存在,且多种乳酸杆菌均具有1个或多个质粒谱。用DNA-cDNA杂交和核苷酸序列分析证实,各种质粒之间具有不同程度的同源性,从而说明质粒间的横向传递和重组是相当频繁的。最近几年开展了有关质粒与细菌特性关系的研究,发现质粒与某些表型,如抗药性、N-乙酰氨基葡萄糖减缓酸的形成、糖苷的代谢、糖代谢、氨基酸代谢、细菌素产生与免疫等密切相关。大多数乳酸杆菌质粒表现出分离稳定性,尤其是小的隐性质粒较大质粒相对更加稳定。经研究表明乳酸杆菌质粒具有如下特点:①大多数乳酸杆菌质粒均为隐蔽型质粒,但已证明某些乳酸杆菌的细菌素、糖代谢有关的酶及抗生素抗性等都是由不同质粒所决定的;②乳酸杆菌质粒具有遗传稳定性;③乳酸杆菌中小型质粒拷贝数高,一般可达30~50个;④部分乳酸杆菌质粒复制子宿主范围广泛,可在其他种类的革兰阳性菌及大肠杆菌中发挥作用,避免了专一性质粒在不同菌株之间使用时不必要的亚克隆;⑤乳酸菌属的某些菌株的质粒也可作为乳酸杆菌的质粒,如由宿主范围广的乳酸球菌质粒pGK12构建出的乳酸杆菌基因转化系统;⑥某些乳酸杆菌质粒没有宿主特异性,如pLP501、pLPE323适用于广泛宿主范围,可在不同种类乳酸杆菌中增殖,而且它们的扩增拷贝数没有明显不同,这说明其在不同宿主菌中DNA复制调控机制是相似的。表1列出了从乳酸杆菌中分离的质粒及构建的质粒。3乳酸杆菌种的诱导表达随着乳酸杆菌分子生物学及基因工程技术的发展,已分离出了乳酸杆菌的各种表达调控元件,对乳酸杆菌基因转录和翻译调控及蛋白质分泌机制有了进一步的了解,并通过对部分质粒DNA序列的测定,然后同已知序列质粒的基因进行比较来推测未知质粒基因功能的途径,相继开发出了乳酸杆菌的克隆载体、表达载体、整合载体。研究发现乳酸杆菌质粒基因中普遍存在两种调控序列,一种是与基因复制起始相关的序列,主要包括两大类:一类是编码蛋白的开放阅读框架ORF,在乳酸杆菌中与质粒复制相关的ORF之间存在同源性。另一类是与调控有关的非编码序列,主要包括复制相关蛋白作用的靶序列、正-负向复制起始点、缺失位点、启动子等复制调控元件。其中乳酸杆菌的启动子对LAB具有高度的选择性,故在LAB表达系统中,很少使用外源启动子,目前已成功用于表达外源蛋白的启动子有lacA、lacR、lacF、T7、xylA、lacS、nisA/nisZ、nisF、usp等,这些启动子的诱导物都是食品级的,如乳糖、木糖和Nisin等,易于构成食品级LAB表达系统,提高转基因LAB工程菌株的安全性;另一种是控制质粒拷贝数和不相容性的DNA序列。质粒的拷贝数是由DNA非编码序列中的重复序列和反转录RNA来控制的。除pLJ1外,所有质粒都有与革兰阳性杆菌质粒复制蛋白(Rep)相似的一种蛋白,根据复制蛋白的功能特性,及和其他质粒复制蛋白结构相似性,推测乳酸杆菌属的小质粒是以滚环(RCR)方式进行复制的,可产生单股DNA中间体的积累。因此具有滚环复制所必需的复制启动元件,这些结构包括正-负复制起始点、复制控制元件和移动元件等,这些序列或元件与其他源于革兰氏阳性菌的质粒的相应区域的广泛的同源性,推测乳酸杆菌质粒的这些序列或元件是通过基因内或基因间传递机制而获得的。4食品级选择性标记的质粒载体传统的乳酸菌载体都带有一个或多个编码特定抗生素(如红霉素、氯霉素等)抗性的基因,如果将抗生素抗性基因投放到环境中或人和动物体内,由于抗性因子的转移,将带来生物安全性的严重后果。为了防止使用抗生素抗性标记所引起的危害,最有效的办法是用安全的食品级标记替代抗生素抗性标记以建立食品级选择性标记的载体。因此,食品级乳酸杆菌表达系统成为该领域研究的前沿和热点,为了开发适用于人和动物的食品级乳酸杆菌表达载体,研究者寻求构建非抗生素标记的质粒载体,现在用于乳酸杆菌表达系统的食品级选择性标记主要有三类:糖类利用标记、营养缺陷型标记、编码细菌素抗性,这样构建出的乳酸杆菌表达系统,载体、受体及诱导物均为食品级,可直接制成口服制剂。所以,食品级的乳酸杆菌工程菌可直接应用于食品工业和医药保健等领域,有着巨大的应用前景和潜在的商业价值。4.1d-木糖发酵糖类作为选择标记,主要是利用某种糖仅为少数乳酸杆菌利用,而其他乳酸杆菌不能利用其为发酵底物,将能发酵这种物质的乳酸杆菌的基因克隆与乳酸杆菌的质粒载体连接,转化不能利用这种物质的乳酸杆菌中进行表达,这样就可通过该物质作为底物来筛选。例如乳酸杆菌中有少数株系可利用D-木糖作为碳源,而且与木糖发酵有关的基因也研究得较为清楚。Posno等把可发酵木糖的戊糖乳酸杆菌MD353染色体上的xyl基因克隆到大肠杆菌-乳酸杆菌穿梭载体pLP3537,得到重组pLP3537-xyl质粒,再将其转入不能利用木糖的干酪乳酸杆菌ATCC393中,结果转化子获得了可利用木糖的能力,由此得到利用木糖发酵作为乳酸杆菌食品级选择标记。另外,Takala等使干酪乳酸杆菌的磷酸化β-牛乳糖酶基因缺失141bp,成为乳糖利用缺陷型,构建的质粒pLEB600含有来源于干酪乳酸杆菌的lacG基因和鼠李糖乳酸杆菌的lacG基因启动子。质粒pLEB600转化乳糖缺陷型干酪乳酸杆菌后即可互补利用乳糖。lacG基因起到选择标记的作用。4.2．质粒的筛选一类为以细菌管家基因缺陷株为受体菌,在质粒上克隆入同源或异源完整的受体菌缺陷基因作为外源基因稳定表达的选择标记。王春风等利用胸苷酸合成酶thyA基因替代穿梭载体pW425e中的红霉素抗性基因,得到重组质粒pW425t,该质粒转化thyA缺陷的嗜酸乳酸杆菌DOMLaS107后,可以在不含胸苷酸的MRS培养基上筛选转化子。此外,还有氨基酸缺陷有关的选择标记。Bron等以丙氨酸消旋酶基因做选择标记,植物乳酸杆菌染色体上含有单一拷贝的丙氨酸消旋酶基因。当该基因缺失时需要在大量的D-丙氨酸上才能生长。含有异源丙氨酸消旋酶基因的质粒,转入缺失丙氨酸消旋酶基因的植物乳酸杆菌中,在不含D-丙氨酸情况下,丙氨酸消旋酶基因就作为选择标记。另外,该质粒也可以转化野生型的植物乳酸杆菌中并可以稳定存在。4.3lactacinf的转染lafI基因是LactobacillusjohnsoniiVP111088产生的LactacinF的免疫基因。将含有lafI基因的质粒pTRK434转化入发酵乳酸杆菌NCD01750,可用加入LactacinF的培养基选择转化子。lafI标记片段小、通用性好,可在许多对LactacinF敏感的乳酸杆菌中使用。此外,嗜酸乳酸杆菌的AciocinA和AciocinB的结构基因和免疫基因已分别在干酪乳酸杆菌与植物乳酸杆菌和发酵乳酸杆菌中表达,这都给利用细菌素免疫基因作为食品级标记提供了可能。5乳酸杆菌tge和耐药目前人们主要利用大肠杆菌作为外源基因的表达系统,但大肠杆菌是潜在的致病菌,且易形成包涵体,不利于外源蛋白的分离和纯化。而乳酸杆菌是公认安全级(GRAS)菌,乳酸杆菌作为外源蛋白的表达载体的最大优点是可以口服,而且乳酸杆菌自身及其各种代谢产物对机体也有营养和免疫功能,再加上其携带的目的蛋白的专一性作用,集多种功能于一体,这就是目前在微生态学领域中提出的多功能微生态制剂,因此乳酸杆菌食品级载体的研究与开发具有相当大的潜力和意义。理想的黏膜免疫疫苗可以促进抗原和免疫系统之间的有效接触、刺激体液和细胞免疫反应、在单剂量免疫以后产生长期的免疫保护作用,并且稳定、无毒性。目前研究得最透彻的致弱病原体载体,因其仍可能保持侵袭性和毒性使它们在应用于儿童和免疫力缺陷者时受到限制。针对基因工程致弱菌大范围应用而带来的安全和环境问题,发展了以乳酸菌为代表的非致病性革兰氏阳性菌载体。乳酸杆菌的一些菌株具有S层(S-layer),由单一的蛋白亚单位组成规则排列的类晶格结构,与大肠杆菌相比,乳酸杆菌仅有一层细胞膜,目的蛋白可在S层蛋白信号肽的引导下直接分泌到细胞外,从而容易获得目的蛋白。用乳酸杆菌作为疫苗载体不仅可使口服的乳酸杆菌刺激产生黏膜及全身免疫反应,提高某些免疫活性因子如IL-2、IFN-α的分泌,而且可将特异性抗原分子携带并分泌到肠道,同时也可穿过肠壁进入黏膜下层,进而引起细胞免疫和体液免疫,因此,乳酸杆菌是一种极有前景的疫苗载体。在“全球健康重大挑战”计划中,有一项“改进儿童疫苗,在婴儿出生后不久即可服用,发展不需要注射的疫苗接种系统”,这项计划展示了未来疫苗开发的重点可能是口服疫苗,因此乳酸杆菌表达系统的研制成功可能会引起一场免疫学界的革命。目前,用破伤风毒素C片段(TTFC)作模型抗原已获得许多乳酸杆菌用于免疫接种的知识,并且结合人们对免疫系统认识的不断提高及近来克隆和表达技术的发展,将能利用TTFC以外的抗原,开辟了乳酸杆菌作为活疫苗载体的真实前景。MariaLeonorS等构建了表达肺炎链球菌表面抗原A乳酸杆菌表达系统,以融合蛋白的形式表达肺炎链球菌表面抗原,获得较好的实验效果。在食品级微生物中,肺炎链球菌抗原的表达为抗此病原开辟了以黏膜免疫接种新途径;P.S.Ho等经胃给药途径利用Lactobacilluscasei表达传染性胃肠炎病毒(TGEV)刺突状糖蛋白诱导特异性抗体的研究,口服免疫接种的动物获得了较好的保护。实验发现,外源抗原基因表达于细胞内或细胞表面,均能诱发针对该抗原的全身和局部黏膜免疫反应,通过口服、鼻黏膜或腹腔注射等途径接种,均可引起有效的免疫应答。更有意义的是,法国和巴西已于2000年联手开展在乳酸杆菌中表达轮状病毒的抗原基因,然后用重组的乳酸杆菌发酵生产酸奶,来预防儿童轮状病毒性腹泻。更深层次的研究,可以将某种抗原基因与其靶位点的靶受体基因融合表达,使抗原基因在体内表达后即可直接到达靶位点