环境扫描电镜观察生物样品的条件

环境扫描电镜观察生物样品的条件

大多数生物样品，如动物、植物、微生物等，具有高含量、低导电性的特点。在传统的高真空条件下，必须进行脱水、干燥和导电性处理。但是,生物样品经上述处理后,不可避免地会产生一些人为变化,如样品的收缩变形、出现结构假象等,故观察到的往往不一定是生物样品的本来面貌。环境扫描电镜(EnvironmentalScanningElectronMicroscopy,ESEM)为解决上述问题带来了希望,ESEM的两个关键技术使直接观察生物样品成为可能。首先,ESEM采用多级压差光阑技术,形成梯度真空,即镜筒保持高真空的同时,样品室可维持高达2.66×102Pa的气压,样品室的温度、气压和相对湿度可以调节;其次,采用气体二次电子探测器,通过二次电子对气体分子的电离作用,一方面使生物样品微弱的二次电子信号放大,另一方面所产生的正离子可消除生物样品表面的电荷积累。这样,含水的、导电性差的生物样品就可以直接在ESEM中获得清晰的图像。尽管ESEM为含水生物样品提供了较好的样品室环境,但毕竟还不是生物所生存的实际环境。因此,那些对环境耐受比较强的生物样品,如牙齿、骨、昆虫、组织工程材料等,很容易在ESEM中观察,而另一些比较脆弱的生物样品如培养细胞、真菌、藻类等则不容易获得满意的观察结果。为了拓展ESEM在生命科学中的应用,我们通过大量实验,选择了较为理想的环境条件组合,建立了不同类型生物样品的观察方法,获得了比较满意的结果。材料和方法1.pelthen冷台XL-30环境扫描电子显微镜(FEI公司),带有Peltier冷台。样品台温度调节范围±20℃,样品室气压调节范围0.13×102Pa～2.66×102Pa。2.生物样品动物组织:皮肤,肝,肾,肺等。植物组织:茎,叶,花,花粉等。昆虫:蚜虫等。微生物:细菌,真菌等。细胞:培养细胞,海藻等。3.实验方法(1)样品室的环境条件选择根据水的相变图中相对湿度等位线,选择不同的温度、气压和相对湿度组合,观察生物样品的形态结构,确定适合生物样品的最佳环境条件。(2)生物样品的保鲜·将未经任何处理的生物样品置于冷台上,在不同的环境条件下观察。·将生物样品经2%锇酸蒸气或2%戊二醛固定液浸泡固定后,置于冷台上,在不同的环境条件下观察。·将生物样品经戊二醛、锇酸双固定,乙醇系列脱水,临界点干燥和离子溅射镀金后在高真空条件下观察。结果与讨论1.不同温度和湿度下生物样品的特性把生物样品放入ESEM中观察时,样品室的环境条件(温度、气压和相对湿度)对观察结果影响很大。在有些条件下,生物样品表面会凝聚水滴、掩盖结构;在另一些条件下,生物样品会干瘪、变形或产生充放电现象;还有些情况下,生物样品周围会形成盐的结晶。显然,这些环境条件都不是合适的生物样品观察条件。我们认为,适合生物样品观察的环境条件应满足下列要求:1)在生物样品表面不凝聚水滴;2)生物样品不发生脱水现象;3)生物样品不发生明显的死后变化;4)没有充放电现象,能获得清晰的图像。通过在不同条件下对各种生物样品的观察,我们认为样品温度4～6℃,相对湿度85%是比较合适的环境条件,其中样品温度5℃,样品室气压7.33×102Pa,相对湿度85%的组合已被我们选择为最佳,也是最常用的环境条件(表1)。在样品室相对湿度为85%时,生物样品表面一般不凝聚水滴,不发生明显的脱水变化,较长时间观察也不发生充放电现象。相对湿度超过85%时,不少样品表面很容易凝聚水滴,掩盖表面结构(图1)。相对湿度底于85%,含水样品会发生脱水收缩,引起变形。湿度越低,脱水越快,有时会发生充放电现象(图2)。根据水相变图中的相对湿度等位线,每一个温度点只要改变气压都可以达到85%相对湿度。我们选择4～6℃,是因为在这一温度范围内要达到85%相对湿度的气压为6.93×102Pa～7.86×102Pa,此时电子束的部分散射比较小,不影响分辨率;而且在4～6℃低温下,生物样品的死后变化小,有利于形态观察。我们的试验结果表明,在5℃、7.33×102Pa、相对湿度85%的环境条件下,多数生物样品既不发生水的凝聚,又不发生脱水现象,而且死后变化小,没有充放电现象,能获得较满意的结果。2.生物样品的观察方法在选择好合适的环境条件后,针对具体生物样品还需根据实际情况采用不同的观察方法和步骤。(1)样品室环境条件的确定这类样品包括动植物的体表结构、昆虫、真菌等,其表面没有可流动的液体,可不经任何处理直接在ESEM中观察。具体方法是:①将样品用双面胶固定于样品台上。②将样品室环境条件调至5℃,6.13×102Pa～6.53×102Pa(相对湿度70%～75%),观察样品表面是否有水滴,如没有水滴即可转下一步。如有水滴,待其蒸发后,再转下一步。③将样品室环境条件调至5℃,7.33×102Pa(相对湿度85%)。④观察和摄像(图1,图2)。(2)湿度预处理法。在做这类样品包括动物面对外界或体腔的内腔面(气管、肠粘膜表面等),动物和植物组织的切面,以及贴壁培养细胞等。在样品表面有不同程度的液体存在,必须经过预处理后,才能观察。具体方法是:①用生理盐水洗去样品表面粘液或其他液体。②将样品用双面胶固定于样品台上,用滤纸吸去表面水分。③将样品室环境条件调至5℃,6.13×102Pa～6.53×102Pa(相对湿度70%～75%),使样品表面剩余水分缓慢蒸发。在水滴接近消失时,转下一步。④将样品室环境条件调至5℃,7.33×102Pa(相对湿度85%)。⑤观察和摄像(图3)。(3)滤纸上所有液体的蒸发这类样品包括悬液培养的细胞、细菌和水生单细胞生物如海藻等。具体方法是:①将微孔滤膜固定于样品台上,用吸管将样品连同液体滴于滤膜上,用滤纸吸去大部分水分,但仍保留少量液体。②将样品室环境条件调至5℃,6.13×102Pa～6.53×102Pa(相对湿度70%～75%),使样品周围液体缓慢蒸发,在显示器上观察水分减少情况,待水分接近消失时,转下一步。③将样品室环境条件调至5℃,7.33×102Pa(相对湿度85%)。④观察和摄像(图4)。3.影响生物形态的测量在合适的环境条件下,生物样品一般不需要固定即可在ESEM中观察。但是由于气压和电子束轰击等原因,生物样品在ESEM中观察时间太长会产生变形。生物样品在ESEM中的承受能力与其含水量和结构成分密切相关。含水量少的样品如动物的毛发、指甲、牙齿,植物的种子,昆虫的甲壳等,含有较多的硅质、钙质、角质和纤维素,表面不易变形收缩,这类样品可承受很长时间观察,即使在低真空下也能获得很好的观察效果。有些生物样品含水量很高,结构脆弱易变形,如真菌、培养细胞、藻类等,在ESEM中能承受的时间比较短,一般在30分钟左右。对这些样品,如果需要较长时间的观察,可以考虑先用化学固定后再在ESEM中观察。化学固定可使组织和细胞成分产生交联作用、形成相对稳定的支架,使其不易变形。根据样品种类可选择不同固定剂。(1)固定服剂、封盖对于表面没有液体的生物样品,可用锇酸蒸气固定。将样品置于金属样品篮内,悬挂于盛有少量2%锇酸固定液的广口瓶中,盖上密封盖,在锇酸蒸气中固定2h以上。固定后的样品可直接置于样品台上观察(图5)。(2)生物样品的制备对于表面有液体的样品以及培养细胞等,可用2%戊二醛固定液浸泡固定。生物样品用2%戊二醛固定液固定后,必须用缓冲液充分漂洗后才能用于观察。手术标本也可用甲醛固定液固定(图6)。4.生物形态研究ESEM可观察未经任何处理的生物样品,这一优点为生物样品的形态研究提供了新的手段,不少常规扫描电镜没有解决的问题可望得到解决,有着一定的应用前景。(1)人为变化的变化目前对生物样品表面形貌的认识主要是用常规扫描电镜获得的,很难排除由于样品制备过程所造成的人为变化。ESEM观察的生物样品可不经任何处理,就有可能观察到更接近于生物样品的真实面貌。开展ESEM与常规扫描电镜的比较研究,可为了解生物样品的形态结构提供新的信息和资料(图7)。(2)形态结构观察不少生物样品结构很脆弱,经过脱水,临界点干燥和导电处理往往会严重变形,较难在常规扫描电镜中观察到其正常形态结构;还有些生物样品很细小,如单细胞生物,在样品制备过程中很难收集和处理,也不容易用常规扫描电镜观察。这些生物样品若用ESEM观察,则很容易看到其真实面貌(图4)。(3)抑制剂、受体、酶在电镜细胞化学技术中,常用金标记方法检测细胞的抗原、受体、酶等。在常规扫描样品制备中,由于样品表面喷镀金属,往往影响金标记的观察,ESEM技术没有这个问题,为细胞化学研究提供了方便。(4)生物样品线元素分析在ESEM中进行生物样品的X线元素分析,可以排除由于样品处理(固定、导电处理)产生的干扰,获得更精确的结果。(5)关于实践的研究人们期望在电镜中观察活