神奈川现象检测及其产生耐岩溶性弧菌的初步研究

神奈川现象检测及其产生耐岩溶性弧菌的初步研究

嗜血性嗜血性主要分布在沿海水域、海与海之间的交汇处和海洋中。它是沿海地区引起食物中毒的重要病原体。日本学者认为副溶血性弧菌的神奈川现象与肠道致病性间有着密切的关系,此阳性反应是由副溶血性弧菌产生的耐热的直接溶血毒素(TDH)所造成的。据Kato氏报道,几乎所有病人大便中分离的副溶血性弧菌在神奈川现象培养基上都显示溶血,而海水中分离的菌株仅有1%显示神奈川现象阳性。采用一般的细菌培养分离方法很难从环境及食品中检出神奈川现象阳性并且产生TDH的副溶血性弧菌,因此对利用免疫磁珠法(ImmunomagneticSeparation)分离环境及食品中产生TDH副溶血性弧菌的可行性进行了研究。免疫磁珠法,是将磁性微株与特定K型抗血清混合后,使K抗体吸附于磁株上,再将样品与免疫磁株振荡混匀,样品中带有特定K抗原的细菌就会与抗体发生特异性结合而被吸附于磁株上,在磁场的作用下,吸附了样品中带有特定K抗原的细菌的磁株就会向磁极方向移动并聚集在容器内壁,将样品液体移出,从而达到有效地浓缩和收集目的菌的方法。1材料和方法1.1样本来源1999年7月~2000年6月由日本静冈县内渔港采集的海水29份、海泥25份,2000年6月~10月采集的市售蛤15份。1.2增菌剂、免疫磁珠法1.2.1取海水1L经滤膜过滤后,将滤膜置入100ml碱性蛋白胨水中,37℃培养18hr海泥25g置入225ml碱性蛋白胨液中,37℃培养18hr;取蛤肉25g置于添加2%NaCL的胰胨大豆培养液225ml中,37℃培养6hr后,转种氯化钠多粘菌素B肉汤培养18hr。培养基系日水制药株式会社和荣研化学株式会社产品。1.2.2PCR法检测上述培养液中tdh遗传因子存在与否。PCR反应条件:93℃,1.4min,55℃,1.8min,72℃,1.0min,35个循环。1.2.3对PCR法检测tdh阳性的海水、海泥进行氯化钠多粘菌素B肉汤18hr选择性第二次增菌后,再行多粘菌素B肉汤6hr第三次增菌培养;对蛤肉进行PCR法检测tdh阳性的多粘菌素B肉汤6hr第三次增菌培养。1.2.4使用免疫磁珠法使第三次增菌液中目的菌与免疫磁珠结合1.2.4.1免疫磁珠的制备:取磁株液(DYNAL社生产的DynabeadsM-280Sheepanti-RabbitIgG)0.5ml加入1ml洗液(PBS-Tween)中混匀,3000rpm离心2min,弃去洗液,清洗2次后,再加入0.5ml洗液,使磁株悬浮于其中,然后加入副溶血性弧菌K6免疫血清1ml,于4℃环境条件下,垂直于水平面轻缓旋转振荡18hr,再用1ml洗液洗净5次后,将免疫磁株放4℃冰箱保存备用。1.2.4.2将1ml检样第三次增菌液加入盛有20μl免疫磁株的小管中,于室温垂直于水平面轻缓旋转振荡30min后,将小管置于磁场旁3min,移出样品液体,再加入1ml洗液,与免疫磁株混匀后,置于磁场旁3min,吸出洗液,重复洗3~5次后,加入100μlPBS-Tween,使吸附有目的菌的免疫磁株与之混匀。1.2.5分别取免疫磁株处理液50μl划线接种2块TCBS平板(划线需使用非金属工具)。1.2.6挑取TCBS平板上蓝绿色菌落点穿刺接种于神奈川现象培养基。有溶血现象者则判定为TDH阳性。1.2.7对TDH阳性菌株进行血清凝集反应,并同时进行反相被动血球凝集检验,以对其产生的TDH予以确认。2神奈川现象阳性患者及其分离株的分离率2.1由PCR法测得的52%(15/29)的海水、12%(3/25)的海泥及53%(8/15)蛤肉中的副溶血性弧菌带有tdh遗传因子。对tdh阳性检体培养液用免疫磁株进行对带有特定K抗原的菌株的浓缩、收集后,接种于神奈川现象培养基,分别从1份海水、1份海泥和3份蛤肉中检出神奈川现象阳性并且产生TDH(反相被动血球凝集均为阳性反应)的副溶血性弧菌,血清型为O3:K6。该血清型与同年静冈县境内发生的副溶血性弧菌食物中毒患者分离株中检出率最高的血清型一致。2.2是否使用免疫磁珠对带有特定K抗原的菌株进行浓缩、收集,TDH阳性株的分离率也有着明显的差别(见附表)。经免疫磁株处理后的分离率远远高于未经处理样品,据文献报道,使用免疫磁珠法从10份海水中的4份中检出了TDH阳性副溶血性弧菌,而同时对3份TDH阳性检体未使用免疫磁珠处理的菌液,每份检体挑取50个菌落接种神奈川现象培养基,结果却全部为阴性。这一结果充分说明免疫磁珠法对环境样品中的带有特定K型抗原的副溶血性弧菌起到了明显的浓缩、收集作用。3tdh阳性副溶血性弧菌的检测方法利用免疫磁珠分离技术可有效地收集、浓缩大量样品中的少量病原微生物,免疫磁株法为难于从环境及食品中分离病原性副溶血性弧菌的问题提供了一种有效手段,也为研究TDH阳性副溶血性弧菌在环境中的分布及由其引起的食物中毒的预防提供了重要依据,该方法对于水和食品中致病微生物的快速分离和检验也有着重要的应