海洋细菌hy-1的分离鉴定及抗金黄色葡萄球菌的分子鉴定

海洋细菌hy-1的分离鉴定及抗金黄色葡萄球菌的分子鉴定

材料和方法1材料表面1.1海泥样品采集自烟台第一个海滨浴场附近。1.2标准菌株标准株金黄葡萄球菌和大肠埃希菌为本实验室保存菌种;MRSA为军事医学科学院赠予。1.3细菌基因组dna提取rTaq聚合酶、dNTP、pMD-18T载体、DH5α感受态细胞均购自大连宝生物制品有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物技术有限公司;其他试剂均为国产分析纯。1.4pcrDYY-ZC型电泳仪,购于北京市六一仪器厂;自动CCD凝胶成像系统,购于天能科技有限公司;隔水式电热恒温培养箱,购于上海跃进医疗器械厂;BS-2F振荡培养箱,购于国华电器有限公司;9600型PCR扩增仪,为美国PekinElmer公司产品;超净工作台(SW-CJ-1F型),购于济南绿之洁科技有限公司;紫外可见分光光度计,购于北京普析通用仪器有限责任公司。1.5响应面树高氏一号固体培养基,含2.0%可溶性淀粉、0.1%KNO3、0.05%NaCl、0.05%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O、0.001%FeSO4、1.5%琼脂,pH7.2～7.4。LB培养基:含1%蛋白胨,0.5%酵母膏,1%NaCl,固体培养基加1.5%琼脂,121℃灭菌20min。2方法2.1混悬液的稀释和浓度的配制取采自不同地点的海泥样品各1g,加无菌水10ml,充分振荡混匀,使成10倍稀释的混悬液(0.1g/ml)。取上述样品混悬液1ml,用9ml无菌水稀释,使成100倍稀释的混悬液(0.01g/ml)。上述两种混悬液各吸取200μl,分别均匀涂布于高氏一号培养基上,28℃培养3～9d。培养过程中每天观察细菌生长情况,待菌落形成后适时挑取形态不同的单菌落,划线接种于新的平板培养基上,继续在28℃培养箱中培养,并从中再次挑取单菌落划线培养,直至分离得到纯菌株,命名HY-1。2.2实验培养基的革兰显微观察对分离纯化得到的菌株先后接种高氏一号和LB固体培养基,分别于28℃培养3～7d和37℃培养1～2d,革兰染色后光学显微镜下观察。2.3受试菌的筛选将纯化得到的菌株进行抗菌谱的测定。抑菌试验采用纸片扩散法,分别采用划线接种法和混合倒平板法,受试菌分别为金黄葡萄球菌、大肠埃希菌和MRSA。37℃培养1～2d观察结果。2.41srdna分析将细菌HY-1接种在平板上,37℃培养过夜。取单一菌落接种于4mlLB培养基中,采用索莱宝公司试剂盒提取细菌基因组。PCR扩增的正向引物16SrDNAF:5′-CGGCGTGCCTAATACATGCAAG-3′;反向引物16SrDNAR:5′-GGCATGCTGATCCGCGATTACTA-3′(引物由上海博尚生物技术公司合成)。50μlPCR反应体系:模板1μl,2×mix25μl,16srDNAF3μl,16SrDNAR3μl。PCR反应条件:94℃预变性6min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸80s,共30个循环;最后72℃温育10min。PCR扩增产物用GelExtractionKit试剂盒DNA纯化系统回收,交由上海美吉工程技术公司进行序列测定。测序后的16SrDNA序列与GenBank数据库进行BLAST比对。选取同源性较高(>97%)的16SrDNA基因序列作为参比对象,构建系统进化树。使用ClustalX1.83软件进行多序列比对,然后采用邻位相接法(Neighbour-joining)和利用MEGA3.1软件绘制系统进化树。结果1培养基的生长在分离培养过程中,HY-1菌株对其他菌株有抑制作用(图1)。纯培养菌能分解淀粉,菌落周围有明显的溶淀粉圈。在高氏一号培养基上28℃培养7d,菌落生长缓慢,稀疏,较小,白色半透明,表面光滑,边缘不整齐,似雪花状;在LB固体培养基上37℃培养2d,菌落生长快速,铺满整个平板,表面光滑,有突起,粘稠,乳黄色,边缘不整齐,直径约为1～2mm。该菌革兰染色阳性,杆状,产芽胞,芽胞位于中央或偏向一侧,小于菌体,似炭疽杆菌。2抑菌活性活性采用纸片法测定HY-1菌株对金黄葡萄球菌、大肠埃希菌、MRSA的抑菌活性。其中对金黄葡萄球菌有较强的抑制作用(图2),对大肠埃希菌和MRSA的抑制作用较弱。316细菌基因组检测挑取纯培养的单一菌落HY-1培养过夜,提取细菌基因组,以特定引物进行PCR扩增并回收、纯化16SrDNA,1%琼脂糖电泳检测其大小为1254bp(图3)。416srdna分析HY-1菌株的16SrDNA序列提交GenBank核苷酸序列数据库,GenBank号为JN851704。为进一步确定该海洋细菌的分类地位,将测序结果进行BLAST,选取相关的14个细菌的16SrDNA的序列结果进行系统关系分析,用MEGA3.1软件构建系统树(图4)。经过同源性分析,HY-1与蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌聚成一枝,同源性达100%,与枯草芽胞杆菌和短小芽胞杆菌的相似度为98%。综合HY-1的形态、生理生化特征和16SrDNA的序列结果,将HY-1鉴定为蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)。关于海洋细菌的活性成分自从1966年第一株有抑菌作用的海洋细菌被发现以来,越来越多的具有抑菌活性的细菌被分离出来。目前已报道的这类海洋细菌主要有假单胞菌(Pseudomonas),交替单胞菌(Alteromonas),弧菌属(Vibrio),螺菌属(Spirillum),玫瑰杆菌(Roseobacter),光合细菌(Photosynbacter),藤黄微球菌(Micrococcusleteus),烟草节杆菌(Arthrobacternicotiana)等。徐长安等筛选到1株海洋芽胞杆菌对鳗弧菌有较强的致病作用,并应用于海水养殖中。李淑彬等从大亚湾海底沉积物中分离到1株具有广谱抗真菌活性的曲霉,该菌对多种酵母菌、皮肤感染菌均具有强烈的抑制活性。吕家森从海洋微生物中分离到多株对肿瘤细胞的生长具有抑制作用的海洋细菌。本研究从海泥筛选到1株对金黄葡萄球菌有较强抑制活性的海洋细菌HY-1。该菌在高氏一号培养基上生长缓慢,菌落小,雪花状,而在LB固体培养基上生长快速,菌落较大。常规细菌学方法检测该细菌为革兰染色阳性杆菌,产芽胞,能溶解淀粉,具有芽胞杆菌属的特征。该菌对金黄葡萄球菌有较强的抑制作用,而对大肠埃希菌和MRSA作用甚微。从系统发育树上看,该细菌与芽胞杆菌属的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌同源性最高。与其他芽胞杆菌如枯草芽胞杆菌相似性也较高,而与居藻芽胞杆菌(Bacillusalgicola)相似度较所列出的其他芽胞杆菌相似度低。本研究从形态、生理生化、系统发育学、16SrDNA序列同源性等方面分析,将菌株HY-1鉴定为蜡样芽胞杆菌,并证明该菌对致病性金黄葡萄球菌具有较强的抑菌活性,为深入研究其抗菌谱及筛选产生抗生素的新型海洋微生物奠定了基础。海洋微生物次生代谢产物是新颖结构和活性天然产物的重要来源,也是抗菌药物发现的重要源泉。作者分别从烟台第一海水浴场近海海水、海泥以及烟台大学近海海水中筛选具有抗菌活性的菌株,采用纸片扩散法测定样品的抑菌活性,发现纯化的来自于海泥样品的细菌对金黄葡萄球菌具有较好的抑菌作用。本研究进一步对该菌株的形态、生理生化、16SrDNA序列同源性、系统发育学进行分析比较,以期确定其分类地位。***金黄葡萄球菌是一种危害严重的机