应用比较基因组杂交技术分析乳腺乳头状肿瘤不同类型染色体基因组dna的变化

应用比较基因组杂交技术分析乳腺乳头状肿瘤不同类型染色体基因组dna的变化

乳腺癌和肿瘤是罕见的乳腺癌，近年来发病率逐渐升高。2003年WHO新分类中将其分为良性、交界性、恶性3种,其不同的病理类型反应了该瘤由良性发展为恶性的过程。我们应用比较基因组杂交(comparativegenomichybridization,CGH)技术分析乳腺叶状肿瘤不同类型染色体基因组DNA拷贝数的变化,初步探索该肿瘤的分子细胞遗传学变化,为进一步从全基因组染色体角度研究该瘤的恶变机制提供较有价值的资料。一、内镜标本检测1.病例选择与标本处理:9例乳腺叶状肿瘤抽取自天津医科大学肿瘤医院乳腺病理研究室2001～2004年存档标本,经2名主任医师依据2003年WHO分类复习原HE切片并确诊,其中良性、交界性、恶性各3例。2.石蜡包埋组织基因组DNA的提取:以HE切片作为参照,选取组织蜡块中肿瘤间叶组织(肿瘤细胞占到90%以上),10μm厚切片,使用EZNA组织DNA提取试剂盒(美国OmegaBio-tek公司)提取基因组DNA,提取过程按照试剂盒说明书进行。3.中期染色体标本的制备:按常规遗传学实验室中期染色体标本的制备程序进行。将制备好的正常男性或女性外周血标本在室温下放置1周,标本检测质量合格者用于CGH。55℃烤箱烤片5～7h,于-20℃低温冰箱保存备用。4.通过缺口平移进行DNA标记:BIONICKTM标记系统(Invitrogen公司)标记肿瘤组织的基因组DNA,地高辛-11-dUTP(1nmol/μl,罗氏诊断公司)与NickTranslation系统(Invitrogen公司)标记正常组织基因组DNA。具体标记过程按照相关试剂盒说明书进行。5.CGH探针的制备:在1.5mlEppendorf管中依次加入标记好的肿瘤DNA和正常DNA各200ng、人Cot-1DNA30μl、3mmol/L乙酸钠5μl、2.5倍体积的冰乙醇约160μl,-80℃低温冰箱中2h;4℃14000r/min离心30min;轻轻倒掉乙醇,室温风干20～30min;将探针溶于杂交液中混匀。6.中期染色体片杂交前的预处理:(1)RNaseA预处理:每片染色体片加稀释的RNaseA100μl,37℃1～1.5h;室温下2×SSC洗涤5min,梯度乙醇脱水,室温干燥。(2)胃蛋白酶处理:将上述中期染色体片放入37℃2×SSC中20min;37℃新鲜配制的0.01mol/LHCl/pepsin溶液中10min;梯度乙醇脱水;室温干燥。7.变性和杂交:将玻片标本变性液在75℃水浴中预温至(73±2)℃;处理好的染色体片置变性液中1min;在乙醇系列中脱水;室温风干;同时将CGH探针在75℃水浴中变性10min;在恒温板上将CGH探针加到事先标记好的区域上,37℃湿盒中杂交3d。8.杂交后洗脱;使用生物素/地高辛双色标记检测试剂盒(北京诺赛基因组研究中心有限公司),按照试剂盒说明书进行操作。9.显微照相和图像分析;在数字化染色体分析工作站进行。染色体获得、扩增和丢失的判定标准分别为实验结果所得曲线>1.25、>1.5和<0.75(图1)。二、乳腺癌组织学检测1.9例乳腺叶状肿瘤CGH分析实验数据:在良性、交界性和恶性乳腺叶状肿瘤中,染色体的变化平均分别为8、19和25个区域。如例1为良性叶状肿瘤(图1),在5q14-15,6q13-14.1处有获得,在1p36.13-36.3,9q34处有丢失,无扩增区;例6为交界性叶状肿瘤,在1p21.1-q21等处有获得,在1q44等处有丢失,无扩增区。2.染色体共同丢失、获得和扩增情况:乳腺良性叶状肿瘤的共同染色体丢失区为9q34(2/3)。乳腺交界性叶状肿瘤在4p12、9q21.11、13q12.1、14q11.2处有共同获得(2/3),在8q24.2、9q34、12q24.3、16q23.2-24、20q13.3、21q22.2-22.3、22q13、15q26.1-26.2处有共同丢失(2/3);3例均在1q21,4q12处有获得,在17q25.1-25.2和19q13.2-13.4处有丢失;仅1例出现9p12.13和14p11.2处的扩增。乳腺恶性叶状肿瘤在3p12-13、4p12-q13.1、5p13.1-q11.2、6q12-13、7p12.1-21.1、8q11.2、8q12.1、9p12、9p21.1、9q12、10q11.21、14q11.2-12、15q11.2-13、16p11.2-11.6、16q12.1-13、18p11.2、19q13.1、Xp11.3处有共同获得(2/3);在2q37.2、9q34.1、12q24.22-24.32、17q25.2、20q13.1、20q13.3、22q13.2-13.3处有共同丢失(2/3);在1p12-13.2和15q11.2处有共同扩增(2/3),3例都有1p12-13、11p11.2、18p11.2处的获得。全部病例1q处的获得最常见(7/9),其次是1p、9q处的获得(6/9),丢失区最常发生在9q、17q(6/9),3p处未见染色体丢失。三、内镜内镜研究CGH技术可以了解全基因组各染色体区段的扩增或缺失,用少量的DNA就可以检测到肿瘤恶变过程不同阶段、肿瘤不同进展时期以及不同类型肿瘤细胞整个基因组水平的非随机性染色体DNA拷贝数的改变。因此CGH技术特别适用于显示肿瘤发生发展过程中癌前病变、浸润性癌、转移癌等染色体基因组的改变,从而显示在癌变早期起始阶段、肿瘤进展或转移阶段起作用的原癌基因或肿瘤抑制基因的定位。目前,有关CGH的文献90%以上是涉及肿瘤研究。国外仅检索到2篇将CGH技术用于乳腺叶状肿瘤的研究;国内则多为综述类文章。对于已发表的2篇国外文献,其研究结论不一致。其中1997年Lu等应用CGH技术研究了18例患者的19份样本,结果发现1q处的获得(7/18)和3p处的丢失(6/18)最常见,1q处的获得与肿瘤间质过度生长有关,而且1q处的获得与肿瘤复发有相关性,于是认为其可能是局部侵袭性的一个标志,对有1q处获得的病例应给予更为积极的治疗。而2003年Jee等对22例乳腺叶状肿瘤应用CGH技术研究DNA拷贝数的变化,应用杂合子丢失(LOH)技术研究3p处的等位失衡,发现1q处的获得是该瘤常见的异常,DNA拷贝数的变化与叶状肿瘤的组织学分级和临床行为无相关性,3p处的染色体改变罕见。