红穿破石药材hplc指纹图谱研究

红穿破石药材hplc指纹图谱研究

红色穿刺石是李科植物的翼果。它主要产于广西和其他地方。它具有清热、补水、利尿和通淋的作用，尤其是结石，对增加收入和尿便、急性肾炎和尿石也有特效药单。从广西产红穿破石根和茎中分离得到大黄素、大黄素甲醚等多种成分,其中大黄素为该植物的主要化学成分。现有的质量标准研究仅有对其大黄素进行定量分析。因此,我们对红穿破石进行指纹图谱研究,建立一种能较全面反映其质量并对其质量进行控制的行之有效的方法。1红穿破石药材检测BUG40超声波清洗器(上海必能信公司);Waterse2695,Agilent1100高效液相色谱仪。红穿破石药材由广西玉林制药有限责任公司提供,经玉林制药有限责任公司质量部鉴定为正品;大黄素对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号110756-200110)。甲醇为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。2方法和结果2.1提取的色度条件和方法的确定2.1.1样品处理方法的确定根据红穿破石中所含主要成分,供试品溶液提取方法的考察比较了采用甲醇超声处理和甲醇加热回流不同提取时间的提取效果,结果指纹图谱相似,而以超声提取20min及回流提取30min以上峰强度最大,因此,样品的处理选用相对简便的超声提取20min。2.1.2吸收波长的考察采用PAD检测器进行全波长检测,并结合大黄素的最大吸收波长进行考察。在254、291nm波长下的HPLC图谱中均有相同数目的色谱峰。291nm波长下,峰强度较大,因此选定291nm作为检测波长。2.1.3色谱柱分离和分析选择了3种不同填料的色谱柱:AgilentTC-C18、LichrospherC18、KromasilC18,结果3种色谱柱分离大黄素及其他指纹峰均有较好的峰型和稳定性,且三者的色谱图基本一致,在红穿破石分析中可通用。2.1.4洗脱系统选择分别比较了甲醇-0.1%磷酸溶液的不同梯度洗脱效果,结果以“2.2.1”项下梯度系统分离度较好,所有峰均基本达到基线分离,故选择其作为洗脱系统。2.2红透破石谱研究2.2.1样品系统及运行时间用十八烷基键合硅胶为填充剂(AgilentTC-C18柱,250mm×4.6mm,5µm),柱温35℃,甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B)系统,按表1梯度洗脱,流速1.0ml/min,运行时间60min,检测波长291nm,进样量10μL。2.2.2超声处理法取红穿破石中粉0.2g,精密称定,精密加入甲醇20mL,称定重量,超声处理(50Hz,250W)20min,放冷,用甲醇补足减失的重量,摇匀,经0.45μm滤膜滤过,即得。2.2.3对照溶液的制备2.2.4色谱图的测定精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,记录60min的色谱图,结果见图1、图2。以图2与图1进行比较,在样品图中的大黄素色谱峰(12号峰)能得到较好的指认,因此在相似度软件计算中,均以此峰作为参照色谱峰,有助于红穿破石指纹图谱色谱峰的指认。2.2.5红透破石涂料的指纹图2.3指纹图的方法研究2.3.1指纹图谱检测非共有峰面积的分析以保留时间约为38.9min的12号色谱峰作为参照峰,对10批药材的指纹图谱进行考察,确定了13个共有峰。并对各峰的相对保留时间及相对峰面积进行了计算,统计各批样品非共有峰与总峰面积的百分比,其结果为非共有峰面积百分比在1.25%~3.31%之间,符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中“非共有峰总面积不得大于总峰面积的10%”的检测要求。具体数据见表2、表3。以红穿破石主要产地广西所产药材为重点研究品种,于广西区内共收集7批药材,其他地区药材3批,按文中的方法进行色谱分析。将10批药材的色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2O04年A版相似度软件,考察色谱峰相似度的一致性,进行相似度的评价。具体数据见表4。2.3.2仪器精密度试验精密吸取同一供试品溶液10μL,注入色谱仪,重复进样5次。可定量的色谱峰有19个,其中的13个色谱峰重复性好,其相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于5%,13个峰占总峰面积的95%以上,表明仪器精密度良好。2.3.3溶液稳定性测定取同一供试品溶液,分别在0、4、8、12、23h测定,结果各峰相对峰面积RSD<5%,相对保留时间RSD<5%,表明供试品溶液在23h内基本稳定。2.3.4重复试验3红穿破石药材成分的初步筛选本试验通过对红穿破石药材提取方法等因素的考察,确定了试品溶液的制备方法,考察了检测波长、色谱柱、流动相不同梯度对样品色谱行为的影响,优选了分离红穿破石药材的色谱条件;同时,红穿破石中的有效成分大黄素,其在指纹图谱中的保留时间适中,含量较高且稳定,故以其作为参照峰建立了红穿破石药材的指纹图谱。利用“相似度软件”考察了不同产地10批次红穿破石的相似性。结果表明,该方法操作简便,专属性强,重复性好,能较好地体现红穿破石药材成分的整体性。取大黄素对照品适量,精密称